Name: Izolacja i aktywacja in vitro plemników Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-31T19:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Poznaj izolację i aktywację plemników Caenorhabditis elegans in vitro. Ta metoda obejmuje dyssekcję samców, wizualizację morfologii gamet oraz aktywację spermatyd przy użyciu pronazy. Protokół umożliwia badanie funkcji plemników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Samuelowi Wardowi, Diane C. Shakes i Gregory'emu Nelsonowi za opracowanie tej techniki. Dziękujemy Pavanowi Kadandale i Brianowi Geldzilerowi za materiały wideo przedstawiające aktywowane spermatozoa; członkom laboratorium Singsona za pomocne dyskusje; CGC za udostępnienie szczepów oraz NIH za wsparcie poprzez grant (R01HD054681).

1) Wzbogacenie populacji samców
<ol>
	<li>W zależności od potrzeb eksperymentalnych, dużą liczbę samców można uzyskać, stosując jedną z następujących strategii:
		<ol>
			<li>Dużą populację samców typu dzikiego można uzyskać poprzez skrzyżowanie 5 samców typu dzikiego i 1 hermafrodyty na niewielkim obszarze namnożonych szczepu OP50 w centrum płytki NGM. Około 50% kolejnego pokolenia będą stanowić samce typu dzikiego.</li>
			<li>him-5(e1490) lub him-8(Nie podano tekstu źródłowego do tłumaczenia. Proszę o dostarczenie treści, którą należy przetłumaczyć na język polski.hermafrodyty wydalają liczną populację samców. him-5 i him-8 samce są płodne i nie stwierdzono wyraźnych wad w morfologii i funkcji plemników. Zatem, him-5 lub him-8 można używać samców zamiast samców typu dzikiego do wielu eksperymentów.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2) Identyfikacja i izolacja samców
<ol>
	<li>Zbadaj morfologię ogona nicieni; ogon samca jest zaokrąglony.</li>
	<li>Wybierz samce w stadium L4 i przenieś je na płytkę NGM zaszczepioną E. coli OP50 i pozostaw do wzrostu na jeden lub dwa dni. Hodowanie celibatowych samców w obecności hermafrodytów zapobiega utracie plemników, dzięki czemu podczas procedury eksperymentalnej dostępna będzie duża liczba spermatyd.</li>
	<li>W dniu sekcji przenieś celibatowe samce na płytkę NGM bez bakterii i pozostaw je na kilka minut. Ten krok pomaga usunąć cienką warstwę E. coli przylegającą do powierzchni nicieni. Alternatywnie, nanieś pipetą niewielką objętość buforu M9 (6g Na2HPO4, 3g KH2PO4, 5g NaCl, 0,25g MgSO4.7H2O na litr) na szkiełko zegarkowe i przenieś tam samce.</li>
</ol> 
3) Disekcja samców i aktywacja in vitro
<ol>
	<li>Należy wziąć szkiełko przedmiotowe i zaznaczyć na nim małe koło za pomocą pisaka. W obrębie koła należy nanieść pipetą 30-50 μl 1X Sperm Medium (50mM HEPES, 25mM KCl, 45mM NaCl, 1mM MgSO4, 5mM CaCl2, 10mM Dextrose; pH 7.8). Hydrofobowy okrąg pomaga utrzymać medium dla plemników w wyznaczonym obszarze.</li>
	<li>Przenieść od 5 do 10 samców do medium dla plemników.</li>
	<li>Obserwując szkiełko pod mikroskopem, należy trzymać w obu dłoniach dwie strzykawki z igłami o średnicy 27 gauge.</li>
	<li>Jedną igłę należy wykorzystać do „przytrzymania” nicienia, a drugą do przecięcia tylnego końca samców w celu uwolnienia spermatyd.</li>
	<li>Przecięcie nicienia zazwyczaj powoduje natychmiastowe wydalenie ogromnej liczby spermatyd. Spermatydy są widoczne pod mikroskopem stereoskopowym jako drobne „ziarnistości”. Jednak czasami część lub większość spermatyd może pozostać wewnątrz ciała zwierzęcia. W takim przypadku delikatne „przeciąganie” ciała po szkiełku przedmiotowym może ułatwić uwolnienie spermatyd z organizmu.</li>
	<li>Aby aktywować spermatydy, należy przeprowadzić sekcję nicieni w 1X Sperm Medium zawierającym Pronase E(20μg/ml) i pozostawić je na 5 minut.</li>
	<li>Nie wolno dopuścić do wyschnięcia szkiełek na żadnym etapie eksperymentu. W razie potrzeby należy dodać więcej 1X Sperm Medium.</li>
</ol>
4) Wizualizacja spermatyd i plemników
<ol>
	<li>Ostrożnie połóż szkiełko nakrywkę na powierzchni preparatu.</li>
	<li>Znajdź pole widzenia zawierające spermatydy przy małym powiększeniu (10X).</li>
	<li>Szczegóły budowy spermatyd lub spermatozoów można obserwować, przełączając na większe powiększenie – zazwyczaj 100X z zastosowaniem imersji olejowej.</li>
</ol>
5) Reprezentatywne wyniki
Przykład obrazu DIC spermatyd wyizolowanych od samca C. elegans przedstawiono na Rysunku 1. Spermatydy mają kształt kulisty i wyraźne jądra. Aktywowane in vitro plemniki przedstawiono na Rysunku 2.
<img src="/files/ftp_upload/2336/2336fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy jednokomórkowych mikroorganizmów; skupienie na statycznym układzie i badaniu morfologii." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Obraz DIC spermatyd C. elegans.
<img src="/files/ftp_upload/2336/2336fig2.jpg" alt="Komórki drożdży; obraz mikroskopowy; analiza morfologii komórek; badania nad fermentacją; badanie biologiczne." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Obraz DIC aktywowanych in vitro plemników C. elegans.

<ol><li>Kimble, J., Crittenden, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+of+germline+stem+cells%2C+entry+into+meiosis%2C+and+the+Sperm%2FOocyte+decision+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).</li>
<li>Lhernault, S. W., Roberts, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLhernault%2C+SW+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. , Vol. 48 273-301 (1995).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondisjunction+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 91, 67-94 (1979).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+male+C.+elegans+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22WormAtlas%22%5BJournal%5D)">Introduction to male C. elegans anatomy.</a> WormAtlas. , ColdSpring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2008).</li>
<li>Shakes, D., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+spermiogenesis+in+C.+elegans%3A+a+pharmacological+and+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis.</a> Dev Biol. 134, 189-200 (1989).</li>
<li>Nelson, G. A., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+fusion%2C+pseudopod+extension+and+amoeboid+motility+are+induced+in+nematode+spermatids+by+the+ionophore+monensin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin.</a> Cell. 19, 457-464 (1980).</li>
<li>L'Hernault, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+and+cell+biology+of+spermatogenesis+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).</li>
<li>Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+spe-38+gene+encodes+a+novel+four-pass+integral+membrane+protein+required+for+sperm+function+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization.</a> Development. 132, 2795-2808 (2005).</li>
<li>Xu, X., Sternberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+sperm+TRP+protein+required+for+sperm-egg+interactions+during+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization.</a> Cell. 114, 285-297 (2003).</li>
<li>Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+spermatozoan+locomotion%3A+amoeboid+movement+with+almost+no+actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin.</a> J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).</li>
<li>Machaca, K., DeFelice, L. J., L'Hernault, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+chloride+channel+localizes+to+Caenorhabditis+elegans+spermatids+and+chloride+channel+blockers+induce+spermatid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation.</a> Dev Biol. 176, 1-16 (1996).</li>
<li>LaMunyon, C., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+viability+of+mutant+and+manipulated+sperm+by+artificial+insemination+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 138, 689-692 (1994).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Oprócz analizy mutantów Spe, protokół ten znajduje inne istotne zastosowania, takie jak analiza morfologii plemników w procesie starzenia. Spermatydy i spermatozoya wyizolowane zgodnie z tym protokołem mogą być wykorzystane w innych badaniach, takich jak immunobarwienie plemników typu dzikiego i mutantów8, 9, ocena ruchliwości plemników na preparatach10, pomiary fizjologiczne9, 11, a nawet sztuczne zapłodnienie12.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka tuberkulinowa</td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td>Strzykawka: 1 ml, igła:&lt;br/&gt;27G X &amp;#189; in</td></tr><tr><td>Pisak do histologii (Pap pen)</td><td>Zymed Laboratories, Inc.</td><td>00-8888</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe VWR VistaVision HistoBond</td><td>VWR international</td><td>16004-406</td><td>Wymiary:&lt;br/&gt;75X25X1mm</td></tr><tr><td>Szkiłko nakrywne</td><td>VWR international</td><td>48366045</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6911</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i aktywacja in vitro plemników caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Samce i hermafrodyty to dwie naturalnie występujące formy płciowe u nicienia C. elegans. Plemniki ameboidalne są produkowane zarówno przez samce, jak i hermafrodyty. We wczesnej fazie gametogenezy komórki zarodkowe hermafrodyt różnicują się w ograniczoną liczbę plemników – około 300 – które są przechowywane w niewielkim „worku” zwanym spermateką. Następnie hermafrodyty stale produkują oocyty1. W przeciwieństwie do nich, samce przez cały okres dorosłości produkują wyłącznie plemniki. Samce produkują tak dużą ilość plemników, że stanowią one &gt;50% wszystkich komórek w typowym dorosłym osobniku2. W związku z tym izolacja plemników od samców jest łatwiejsza niż od hermaprodytów.
Tylko niewielka część samców powstaje naturalnie w wyniku spontanicznego niepodziału chromosomu X3. Krzyżowanie hermafrodytów z samcami lub, co jest bardziej wygodne, wprowadzanie mutacji prowadzących do fenotypu Him (High Incidence of Males), to niektóre ze strategii, które pozwalają na zwiększenie liczebności populacji samców3.
Samce można łatwo odróżnić od hermafrodytów, obserwując morfologię ogona4. Ogon hermafrodytów jest spiczasty, natomiast ogon samców jest zaokrąglony i posiada struktury kopulacyjne.
Odcięcie ogona uwalnia ogromną liczbę spermatyd zgromadzonych w obrębie męskiego układu rozrodczego. Disekcja jest przeprowadzana pod mikroskopem stereoskopowym przy użyciu igieł o rozmiarze 27 G. Ponieważ spermatydy nie są fizycznie połączone z żadnymi innymi komórkami, ciśnienie hydrauliczne wypycha zawartość wnętrza ciała samca, w tym spermatydy2.
Samce są bezpośrednio sekcjowane na niewielkiej kropli „podłoża dla plemników” (Sperm Medium). Spermatydy są wrażliwe na zmiany pH. Dlatego w podłożach dla plemników stosuje się HEPES, związek o dobrej zdolności buforującej. Glukoza i inne sole obecne w podłożach dla plemników pomagają utrzymać ciśnienie osmotyczne, co pozwala zachować integralność plemników.
Podział postmeiotyczny spermatyd w dojrzałe plemniki nazywany jest spermiogenezą lub aktywacją plemników. Shakes5 oraz Nelson6 wykazali wcześniej, że okrągłe spermatydy mogą być indukowane do różnicowania się w plemniki poprzez dodanie różnych związków aktywujących, w tym Pronazy E. W niniejszej pracy demonstrujemy spermiogenezę in vitro spermatyd C. elegans z wykorzystaniem Pronazy E.
Pomyślna spermiogeneza jest warunkiem koniecznym dla płodności, dlatego mutanty z wadami spermiogenezy są bezpłodne. Do tej pory wykazano, że kilka mutantów wykazuje defekty specyficznie w procesie spermiogenezy7. Nieprawidłowości zaobserwowane podczas aktywacji in vitro nowych mutantów Spe (Spermatogenesis defective) pomogą nam odkryć dodatkowe czynniki uczestniczące w tym zdarzeniu.

W niniejszym protokole opisano metodę izolacji i aktywacji spermatyd z samców C. elegans. Odcięcie tylnego końca samca powoduje uwolnienie spermatyd. Spermatydy można aktywować poprzez dodanie proteazy.

Izolacja i aktywacja in vitro plemników Caenorhabditis elegans

Samce i hermafrodyty to dwie naturalnie występujące formy płciowe w organizmie nicienia C. elegans. Amoeboidalne plemniki są produkowane zarówno przez samce, jak i...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja morfologii plemników. Jest to realizowane poprzez uprzednią izolację samców do sekcji na jeden dzień przed badaniem. Drugim krokiem procedury jest przeprowadzenie sekcji samców w celu uwolnienia plemników.Trzecim krokiem procedury jest wizualizacja morfologii plemników. Ostatnim krokiem procedury jest przygotowanie plemników do dalszych zastosowań. W rezultacie można uzyskać dane obrazujące morfologię plemników oraz ich zdolność do aktywacji poprzez zastosowanie aktywatorów in vitro.Protokół izolacji i aktywacji plemników został opracowany ponad 30 lat temu przez Sama Warda, Diane Shakes i Gregory'ego Nelsona. Obecnie stosujemy tę procedurę do charakteryzacji mutacji zmieniających funkcję plemników i płodność u C. elegans. Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja morfologii plemników OID u C. elegans.Jest to osiągane poprzez izolację samców na jeden dzień przed sekcją, aby zachować ich celibat. Drugi krok polega na przeprowadzeniu sekcji samców w celu uwolnienia okrągłych spermatyd niemodalnych. Trzecim krokiem jest wizualizacja aktywacji spermatyd in vitro aż do uzyskania morfologii dojrzałych plemników AME.Procedura zostan

isolation-and-in-vitro-activation-of-caenorhabditis-elegans-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Organizm modelowy C. elegans wykorzystuje płyn pseudocelomiczny jako pasywny układ krążenia. Bezpośrednia analiza tego płynu nie była wcześniej możliwa. Przedstawiamy tutaj nową technikę bezpośredniego badania przestrzeni zewnątrzkomórkowej, wykorzystując systemowe sygnały wyciszania podczas odpowiedzi RNAi jako przykład potwierdzający zasadność tej metody.

Wampiryczna izolacja płynu zewnątrzkomórkowego z Caenorhabditis elegans

Nicienie mogą być łatwo rozmnażane w laboratorium - po części dlatego, że hermafrodyty mogą rozmnażać się przez samozapłodnienie. Jednak krzyżówki genetyczne i inne eksperymenty mogą wymagać dużej liczby samców. Ten film opisuje metodę wzbogacania samców C. elegans.

Wzbogacanie dla samców: utrzymywanie stada samców C. elegans

Ten film przedstawia metodę izolowania blastomerów C. elegans z wczesnych zarodków. Otrzymane komórki nadają się do hodowli komórkowej lub eksperymentów ex vivo.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie blastomerów: metoda usuwania skorupki jaja i dysocjacji komórek embrionalnych

Opisujemy tutaj poprawiony protokół dla hodowli na dużą skalę embrionalnych komórek C. elegans. Embrionalne komórki C. elegans hodowane in vitro przy użyciu tej metody wydają się różnicować i rekapitulować ekspresję genów w sposób specyficzny dla komórki. Techniki, które wymagają bezpośredniego dostępu do komórek lub izolacji określonych typów komórek z innych tkanek, mogą być stosowane na komórkach hodowanych przez C. elegans.

Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

Test EIW (egg-in-worm) jest użyteczną metodą do ilościowego określenia zachowania podczas składania jaj. Zmiany w składaniu jaj mogą być reakcją behawioralną organizmu modelowego Caenorhabditis elegans na potencjalnie szkodliwe substancje środowiskowe, takie jak te wytwarzane przez bakterie chorobotwórcze.

Pomiar wpływu bakterii na zachowanie C. elegans za pomocą testu retencji jaj

Plemnik musi pomyślnie przejść przez jajowód, aby zapłodnić oocyt. W tym miejscu opisujemy test do pomiaru migracji plemników w obrębie macicy hermafrodyty C. elegans. Test ten może dostarczyć danych ilościowych na temat rozmieszczenia plemników w macicy po kryciu, a także na temat prędkości, prędkości kierunkowej i częstotliwości odwrócenia.

Pomiar przewodnictwa i ruchliwości plemników w hermafrodytowym układzie rozrodczym Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół prostej izolacji określonych grup żywych komórek neuronalnych wyrażających zielone białko fluorescencyjne z transgenicznych linii Caenorhabditis elegans. Metoda ta umożliwia różnorodne badania ex vivo skoncentrowane na konkretnych neuronach i ma zdolność izolowania komórek do dalszej krótkoterminowej hodowli.

Izolacja określonych populacji neuronów od glisty Caenorhabditis elegans

Genetycznie podatny na uszkodzenia nicień Caenorhabditis elegans może być używany jako prosty i tani model do odkrywania leków. Opisano tutaj protokół identyfikacji leków przeciwnowotworowych, które hamują dalszą sygnalizację białek RAS i EGFR.

Identyfikacja inhibitorów EGFR i RAS za pomocą Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji aktywnego ekstraktu jądrowego z larwalnego stadium 4 C. elegans i wizualizacji aktywności transkrypcyjnej w systemie in vitro.

Izolacja aktywnego ekstraktu jądrowego Caenorhabditis elegans i rekonstytucja do transkrypcji in vitro

Tutaj prezentujemy ogólną metodę określania żywotności embrionalnej i całkowitej liczby wyprodukowanych zarodków (czerwiu) za pomocą organizmu modelowego C. elegans.

Pomiar żywotności zarodka i wielkości lęgu u Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokoły i narzędzia do wizualizacji wapnia podczas zapłodnienia i wczesnej embriogenezy za pomocą genetycznie kodowanego reportera wapnia wyrażonego w linii zarodkowej modelowego nicienia C. elegans.

Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans

Poznaj izolację i aktywację plemników Caenorhabditis elegans in vitro. Ta metoda obejmuje dyssekcję samców, wizualizację morfologii gamet oraz aktywację spermatyd przy użyciu pronazy. Protokół umożliwia badanie funkcji plemników.

Izolacja i aktywacja in vitro plemników Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów