JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 1:30 min • March 4th, 2025
Weźmy utrwaloną w formalinie ludzką tkankę mózgową zanurzoną w parafinie. W tkance widoczne są drobnoustroje chorobotwórcze obecne zarówno wewnątrz komórek, jak i poza komórką.
Umyj w celu usunięcia parafiny, a następnie nawodnij tkankę za pomocą zmniejszających się stężeń alkoholu.
Podgrzej z kwaśnym buforem, aby zerwać wiązania krzyżowe białek wywołane formaliną, demaskując epitopy antygenowe na bakteriach.
Inkubować z chlorkiem amonu w celu zneutralizowania pozostałości reaktywnych grup aldehydowych powstałych podczas utrwalania, zapobiegając niespecyficznym interakcjom z przeciwciałami.
Potraktuj detergentem, aby przeniknąć przez błony komórkowe, ułatwiając penetrację przeciwciał.
Zastosuj roztwór blokujący, aby zapobiec wiązaniu się nieswoistych przeciwciał.
Inkubuj z pierwszorzędowymi przeciwciałami, które są skierowane przeciwko drobnoustrojom zewnątrzkomórkowym i wewnątrzkomórkowym.
Zastosuj przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi.
Dodaj fluorescencyjny barwnik wiążący DNA, aby zabarwić jądra.
Traktuj eliminatorem autofluorescencji, aby wygasić fluorescencję z autofluorescencyjnych granulek wewnątrzkomórkowych, minimalizując sygnały tła.
Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej zbadaj tkankę, aby potwierdzić obecność drobnoustrojów.