JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 1:25 min. • March 4th, 2025
Zacznij od tkanki mózgowej myszy w buforze ekstrakcyjnym zawierającym inhibitory proteazy i detergent.
Homogenizuj tkankę, aby uwolnić białka do buforu. Inhibitory proteazy blokują aktywność proteazy, zapobiegając degradacji białek.
Odwirować i zebrać supernatant z białkami.
Dodaj bufor ładujący zawierający detergent i środek redukujący, aby zdenaturować białko.
Załadować białka z kontroli i próbkę do żelu SDS-PAGE. Zastosuj pole elektryczne, aby rozdzielić białka na wyraźne pasma.
Po elektroforezie przenieś prążki białkowe na membranę.
Potraktuj błonę buforem zawierającym mleko beztłuszczowe, aby zablokować niespecyficzne miejsca interakcji.
Inkubować z pierwotnymi przeciwciałami, które wiążą się specyficznie z fosforylowanymi białkami tau.
Przemyć i inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z enzymami.
Dodaj substrat, który reaguje z enzymem, aby wytworzyć sygnał świetlny, potwierdzając fosforylowane białka tau.
Intensywne pasmo świetlne w próbce w porównaniu z kontrolą sugeruje patologię neurodegeneracyjną.