JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 1:30 min. • March 4th, 2025
Zacznij od białek płynu mózgowo-rdzeniowego, w tym fosforylowanej alfa-synukleiny, biomarkera chorób neurodegeneracyjnych.
Dodaj bufor ładujący zawierający detergent, środek redukujący i barwnik śledzący.
Podgrzej, aby zdenaturować białka, a następnie załaduj je do żelu SDS-PAGE.
Wykonaj elektroforezę, aby rozdzielić białka według masy cząsteczkowej na wyraźne pasma.
Inkubować żel w buforze bibułkowym z mieszaniem.
Następnie przenieś elektrolitycznie pasma białkowe z żelu na membranę.
Potraktuj membranę utrwalaczem, aby zatrzymać białko na membranie, a następnie umyj.
Inkubować z roztworem blokującym zawierającym pierwszorzędowe przeciwciała i inhibitory fosfatazy w celu utrzymania fosforylacji alfa-synukleiny.
Przeciwciała oddziałują wyłącznie z fosforylowaną alfa-synukleiną, a odczynniki blokujące blokują niespecyficzne miejsca interakcji, a następnie przemywają.
Wprowadź sprzężone z enzymami przeciwciała drugorzędowe, które oddziałują z przeciwciałami pierwszorzędowymi, a następnie umyj.
Dodaj substrat chemiluminescencyjny, wchodząc w interakcję z enzymami i generując chemiluminescencję.
Pasmo chemiluminescencyjne potwierdza obecność fosforylowanej alfa-synukleiny.