JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 1:22 min • March 4th, 2025
Weźmy homogenat tkankowy z mózgu ssaka, który zawiera zarówno normalne białka prionowe, jak i nieprawidłowo sfałdowane agregaty prionowe odpowiedzialne za choroby neurodegeneracyjne.
Inkubuj z enzymem proteolitycznym w celu trawienia normalnych prionów, pozostawiając nienaruszone odporne agregaty.
Potraktuj agregaty buforem denaturującym w wysokiej temperaturze, aby zlinearyzować białka i nadać równomierny ładunek ujemny.
Załadować próbkę do żelu do elektroforezy i rozdzielić białka na pasma, co potwierdza obecność agregatów.
Za pomocą pola elektrycznego przenieś oddzielone białka na błonę.
Inkubować błonę w roztworze blokującym, aby zamaskować niespecyficzne miejsca wiązania.
Inkubować z przeciwciałami znakowanymi enzymami peroksydazą, które wiążą się specyficznie z agregatami prionowymi.
Umyj błonę, aby usunąć niezwiązane przeciwciała, minimalizując niespecyficzne sygnały.
Dodaj substrat chemiluminescencyjny i środek utleniający, umożliwiając peroksydazie utlenienie podłoża i wytworzenie światła.
Zmierz natężenie światła, aby określić ilościowo nieprawidłowo sfałdowane priony w homogenacie.