JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 1:22 min • March 4th, 2025
Zacznij od ludzkiej tkanki mózgowej w buforze do lizy.
Homogenizuj tkankę za pomocą homogenizatora, aby uwolnić białka, w tym dekarboksylazę kwasu glutaminowego lub izoformy enzymu, niezbędne do funkcjonowania mózgu.
Inkubować homogenat na lodzie, a następnie odwirować w celu osadzenia zanieczyszczeń. Zebrać supernatant zawierający białko.
Dodać bufor ładujący zawierający detergent i środek redukujący, aby zdenaturować białka.
Załaduj tę próbkę i marker molekularny na gradientowy żel SDS-PAGE i elektroforę, aby rozdzielić białka na wyraźne prążki.
Osusz elektrolitycznie białka z żelu na arkusz membrany.
Dodaj agenta blokującego, aby zapobiec niespecyficznemu powiązaniu.
Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi specyficznymi dla izoformy, które wiążą się z ich receptywnymi izoformami.
Umyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.
Inkubować z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi.
Umyj ponownie i zwizualizuj prążki białkowe w systemie obrazowania.
Wykryj prążki za pomocą fluorescencji i potwierdź różnice w ich masie cząsteczkowej za pomocą markera.