Name: Badania in vivo i in vitro interakcji adaptor-klatryna (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T23:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: Poznaj metody badania interakcji białka adaptorowego Sla1p z klathryną w komórkach drożdży. Wykorzystaj mikroskopię konfokalną i testy GST pull-down do analizy endocytozy zależnej od klathryny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

D.F. otrzymuje wsparcie w ramach stypendium NSF Bridges to the Doctorate. Mikroskop wykorzystany w tej pracy jest częściowo finansowany z grantu na infrastrukturę bazową Microscope Imaging Network z Colorado State University. Prace nad adaptorami klatryny w laboratorium autora są finansowane ze środków startowych CSU oraz z grantu American Heart Association 09SDG2280525 przyznanego S.D.

1. Wprowadzenie znacznika GFP i markera selekcyjnego do genu SLA1
Zastosuj metodę Longtine17 w celu bezpośredniego połączenia znacznika GFP na końcu 3' otwartej ramki odczytu genu SLA1 (K-koniec Sla1p) i jednoczesnego oznakowania genu genem E. coli kanr, który umożliwia selekcję za pomocą G418.
<ol>
	<li>Wygenerować fragment DNA metodą PCR, wykorzystując jako matrycę plazmid pFA6a-GFP(S65T)-kanMX618 oraz następujące primery: forward, 5'-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3' oraz reverse, 5'-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA TTC GAG CTC GTT TAA AC-3'. Podkreślona sekwencja odpowiada specyficznemu segmentowi genu SLA1 bezpośrednio poprzedzającemu (primer forward) i następującemu po kodonie stop (primer reverse). Wyizolować produkt PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie przeprowadzić puryfikację DNA.</li>
	<li>Przygotować 50 ml hodowli szczepu S. cerevisiae SEY6210 (MAΤα ura3-52, leu2-3,12 his3-Δ20, trp1-Δ901, lys2-801, suc2-Δ9 GAL-MEL) 19 w podłożu YPD, hodowanej we wczesnej fazie logarytmicznej (OD60 =0.2-0.6). Wirować w temperaturze pokojowej przez 3 min przy 2,0 x g, a następnie dwukrotnie przemyć sterylną wodą.</li>
	<li>Transformować komórki fragmentem PCR uzyskanym w kroku 1, stosując procedurę z octanem litu20. Przemyć komórki 1 ml sterylnej wody, dodać 1 ml YPD i inkubować przez 4 h w 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem.</li>
	<li>Wysiać komórki na płytki YPD-G418 w celu wyselekcjonowania transformantów opornych na G418, inkubować w 30 °C przez 2-3 dni. Wybrać kolonie i przełożyć je na płytki YPD-G418.</li>
	<li>Za pomocą metody colony-PCR zidentyfikować transformanty, w których moduł GFP-kan został prawidłowo zintegrowany z sekwencjami genu SLA1 poprzez rekombinację homologiczną. Użyć primera forward, który przyłącza się w obrębie otwartej ramki odczytu SLA1, oraz primera reverse, który przyłącza się wewnątrz modułu GFP-kan. Wybrać kolonie, których produkty PCR mają oczekiwaną wielkość, i zweryfikować je poprzez sekwencjonowanie.</li>
	<li>Przeprowadzić przesiew kolonii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby potwierdzić obecność fluorescencji GFP.</li>
</ol>
2. Mutacja wariantowego obszaru klatrynowego (vCB) w genie SLA1
<ol>
	<li>Wprowadź mutację LLDLQ na AAALQ w genie SLA1 (nukleotydy 2407-2415) stosując podejście dwuetapowe15.</li>
	<li>W pierwszym kroku namnóż nukleotydy 1207-1410 oraz 2427-2589 genu SLA1 metodą PCR i sklonuj fragmenty odpowiednio do miejsc NotI/BamHI oraz EcoRI/SalI wektora pBluescriptKS.</li>
	<li>Subklonuj do miejsc BamHI/EcoRI fragment PCR zawierający URA3.</li>
	<li>Przetnij otrzymany plazmid enzymami NotI/SalI, wyizoluj fragment URA3 poprzez oczyszczanie w żelu i wprowadź go metodą transformacji octanem litu do szczepu Sla1-GFP wytworzonego w części 1 lub do szczepu TVY614 (MATa ura3-52 leu2-312 his3-Δ20 trp1-Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 pep4::LEU2 prb1::HISG prc1::HIS3)21.</li>
	<li>Wysiej komórki na uzupełnione pożywki SD pozbawione uracylu. Potwierdź za pomocą colony-PCR i sekwencjonowania, że kolonie Ura+ zawierają prawidłowo zintegrowany URA3 zastępujący fragment vCB.</li>
	<li>W drugim kroku subklonuj nukleotydy 1207-2589 genu SLA1 do miejsc NotI/SalI wektora pBluescriptKS. Używając zestawu do mutagenezy ukierunkowanej QuickChange-XL (Stratagene), zmutuj reszty LLDLQ w vCB na AAALQ. Zweryfikuj wynik poprzez sekwencjonowanie.</li>
	<li>Przetnij otrzymowany konstrukt enzymami BsgI/AgeI i wyizoluj fragment zawierający zmutowany vCB poprzez oczyszczanie w żelu. Wykonaj kotransformację fragmentu BsgI/AgeI wraz z pRS313 (HIS3)2 do szczepu otrzymanego w punkcie 2.3.</li>
	<li>Wysiej komórki na uzupełnione pożywki SD pozbawione histydyny. Przeniesienie kolonii His+ na podłoże agarowe zawierające kwas 5-fluorotykotowy w celu zidentyfikowania komórek, w których sekwencje zmutowane zastąpiły URA3, regenerując tym samym gen sla1 zawierający mutację LLDLQ na AAALQ (sla1AAA). Potwierdź za pomocą colony-PCR i sekwencjonowania.</li>
</ol>
3. Mikroskopia fluorescencyjna
<ol>
	<li>Hodować szczepy drożdży Sla1-GFP oraz sla1AAA-GFP otrzymane w częściach 1 i 2 w 4 ml uzupełnionej pożywki SD w temperaturze 30°C na rotatorze w ciemności, aż do osiągnięcia OD60 = 0,1-0,4. Wirować 1 ml kultury w mikrowirówce przy 4,00 x g przez 1 min w temperaturze pokojowej. Odrzucić ok. 950 μl supernatantu. Resuspender komórki w pozostałej cieczy (~50 μl).</li>
	<li>Nanieść 3 μl zawiesiny komórkowej na szkiełko mikroskopowe i przykryć szkiełkiem nakrywką. Chronić próbkę przed światłem.</li>
	<li>Zamocować szkiełko na obiektywie imersyjnym 10x mikroskopu konfokalnego z dyskiem obrotowym.</li>
	<li>Zlokalizować odpowiednią płaszczyznę ogniskowania komórek, używając oświetlenia w polu jasnym lub lasera 48 nm z odpowiednimi filtrami w celu wzbudzenia i detekcji fluorescencji GFP.</li>
	<li>Przechwycić obrazy time-lapse Sla1-GFP oraz sla1AAA-GFP w komórkach z czasem ekspozycji 50 ms (lub inną odpowiednią wartością) w odstępach jednego obrazu na sekundę przez 150 sekund. Oczekiwany wynik: oznakowane GFP punkty pojawią się na wewnętrznej powierzchni błony ograniczającej komórkę, utrzymają się przez kilka sekund i będą przemieszczać się w stronę centrum komórki, podczas gdy sygnał szybko zanika (co wskazuje na rozkład otoczki).</li>
	<li>Wybrać fragment obrazu, w którym widać pojawianie się, utrzymywanie przez kilka sekund i znikanie punktów. Wyciąć tę sekcję obrazu dla każdej klatki serii time-lapse.</li>
	<li>Wygenerować kymograf reprezentujący tę sekcję obrazu w każdej klatce 150-sekundowego obrazowania time-lapse, wyrównując klatki wzdłuż osi odpowiadającej upływowi czasu.</li>
	<li>Obliczyć czas trwania każdego punktu na podstawie tego, przez ile sekund (klatek time-lapse) punkt jest obecny na kymografie. Należy zauważyć, że każdy punkt powinien „wyginać się” w stronę wnętrza komórki podczas znikania, co odzwierciedla endocytozę i rozkład otoczki.</li>
	<li>Porównać typ dziki Sla1-GFP z sla1AAA-GFP. Powtórzyć pomiary, aby ustalić, czy wyniki są istotne statystycznie. Oczekiwany wynik: punkty sla1AAA-GFP utrzymują się znacznie dłużej (~80 sec) niż typ dziki (~30 sec), co wskazuje na defekt w tworzeniu otoczki15.</li>
</ol>
4. Przygotowanie ekstraktu cytozolowego i całkowitego ekstraktu komórkowego drożdży
<ol>
	<li>Zaszczep 3 litry pożywki YPD odpowiednim szczepem drożdży, np. TVY614 21, i hoduj w 30 °C w inkubatorze z wytrząsarką do osiągnięcia wartości OD60 = 1-2.</li>
	<li>Odwiruj kulturę drożdży w temperaturze pokojowej przez 20 min przy 3 70 x g. Odlej nadsącz, dodaj 3-5 ml sterylnej wody i pipetuj w górę i w dół, aż osad zostanie całkowicie resuspendowany.</li>
	<li>Wlej ~150 ml ciekłego azotu do plastikowego zlewka o pojemności 250 ml. Zamroź drożdże gwałtownie, dodając je kroplami do ciekłego azotu kolistym ruchem, aby uniknąć zlepiania się zamrożonych granulek. Nie dopuść do rozmrożenia granulek; w razie potrzeby dodaj więcej ciekłego azotu.</li>
	<li>Schłodź stalowy pojemnik blendera, wlewając do niego ciekły azot. Pozostaw ciekły azot do prawie całkowitego odparowania. Przenieś zamrożone granulki drożdży do zimnego pojemnika blendera. Zamknij pojemnik zimnym gumowym korkiem i miel granulki drożdży przez 10 sekund. Odwróć pojemnik 3-4 razy, aby wymieszać zawartość, i powtórz etap mielenia dwukrotnie. Zmielone zamrożone drożdże będą miały postać proszku.</li>
	<li>Schłodź lejek i probówkę stożkową o pojemności 50 ml ciekłym azotem. Używając zimnego lejka, przenieś zmielone drożdże do probówki. Zamrożone zmielone drożdże można przechowywać w -80 °C lub użyć natychmiast.</li>
	<li>Aby uzyskać ekstrakt cytozolowy do testu powinowactwa białka fuzyjnego GST (Część 5), odważ 3 g zamrożonych zmielonych drożdży TVY614 do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i resuspenduj w 3 ml buforu A w temperaturze pokojowej (10 mM HEPES, pH 7.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) zawierającego koktajl inhibitorów proteaz (Sigma).</li>
	<li>Zakręć probówkę i odwróć ją kilkakrotnie, aż zawartość całkowicie się rozmroży, a następnie umieść na lodzie.</li>
	<li>Ultracentryfuguj ekstrakt w 4 °C przez 20 min przy 30 00 x g. Ostrożnie przenieś nadsącz (ekstrakt cytozolowy) do probówki stożkowej za pomocą pipety, nie naruszając osadu. Przechowuj ekstrakt cytozolowy na lodzie.</li>
	<li>Dodaj 10 μl zawiesiny (50% v/v) glutathione-Sepharose w buforze A. W celu ułatwienia pipetowania kulek wygodnie jest odciąć koniec końcówki. Rotuj w 4 °C przez 15 min, odwiruj kuleczki w 4 °C przez 2 min przy 1 0 x g i przenieś nadsącz (ekstrakt cytozolowy) do nowej probówki. Odstaw 50 μl ekstraktu jako kontrolę wejściową (input).</li>
	<li>Aby uzyskać całkowite ekstrakty komórkowe do eksperymentów ko-immunoprecypitacji (Część 6), użyj szczepu TVY614 (WT SLA1), szczepu sla1AAA z mutacją LLDLQ na AAALQ wygenerowaną w Części 2 w tle TVY614 oraz szczepu sla1 z delecją genu SLA1, np. GPY3130 23. Odważ 2 g odpowiednich zamrożonych zmielonych drożdży do probówek stożkowych i resuspenduj je w 2 ml buforu A w temperaturze pokojowej, zawierającego koktajl inhibitorów proteaz (Sigma) i 2% Triton X-10.</li>
	<li>Zakręć probówkę i odwróć ją kilkakrotnie, aż zawartość całkowicie się rozmroży, a następnie inkubuj na lodzie przez 10 min, okresowo mieszając przez odwracanie.</li>
	<li>Przenieś materiał do probówek do mikrocentryfugi i wiruj w 4 °C przez 15 min przy 16 0 x g (maksymalna prędkość mikrocentryfugi). Ostrożnie przenieś nadsącz (całkowity ekstrakt komórkowy) do probówki stożkowej na lodzie za pomocą pipety, nie naruszając osadu.</li>
	<li>Dodaj 10 μl zawiesiny (50% v/v) protein A-Sepharose w buforze A. Rotuj w 4 °C przez 15 min, odwiruj kuleczki w 4 °C przez 2 min przy 1 0 x g i przenieś nadsącz (całkowity ekstrakt) do nowej probówki. Odstaw 50 μl ekstraktu jako kontrolę wejściową (input).</li>
</ol>
5. Analiza powinowactwa białka fuzyjnego GST
<ol>
	<li>Wzmocnić metodą PCR fragment zawierający wariant klatrynowego motywu clathrin-box (vCB) białka Sla1p (reszty 803-807), sklonować go do wektora pGEX-5X w celu otrzymania pGEX-5X-vCB. Zweryfikować wynik poprzez sekwencjonowanie.</li>
	<li>Wykorzystując pGEX-5X-vCB jako matrycę oraz zestaw do ukierunkowanej mutogenezy QuickChange-XL (Stratagene), zmutować reszty vCB LLDLQ na AAALQ w celu otrzymania pGEX-5X-vCBmut. Zweryfikować wynik poprzez sekwencjonowanie.</li>
	<li>Wyeksponować GST oraz białka fuzyjne GST-vCB i GST-vCBmut w E. coli (BL21 DE3), oczyścić za pomocą glutationowej Sepharose, eluować z kulek zredukowanym glutationem, dializować przeciwko PBS i oznaczyć stężenie białka.</li>
	<li>Oznakować 3 probówki do mikrocentryfugi: GST, GST-vCB oraz GST-vCBmut, a następnie dodać 1 ml PBS, 30 μl 50% (v/v) zawiesiny glutationowej Sepharose w buforze A oraz 50 μg dializowanych białek fuzyjnych GST, GST-vCB lub GST-vCBmut.</li>
	<li>Inkubować w rotatorze w temperaturze pokojowej przez 30 min, aby umożliwić wiązanie.</li>
	<li>Przepłukać kuleczki 2 razy PBS i 1 raz buforem A. Do każdej probówki dodać 1 ml ekstraktu cytozolowego z drożdży – przygotowanego zgodnie z opisem w Części 4.</li>
	<li>Rotować probówki przez 1 h w 4 °C, wirować przez 10 sec przy 5,0 x g w celu osadzenia kuleczek, odrzucić supernatant i szybko przepłukać kuleczki 3 razy buforem A zawierającym 0,1% Triton X-10 oraz 1 raz samym buforem A.</li>
	<li>Zwiryzować kuleczki jeszcze raz i za pomocą końcówki do nakładania próbek na żel usunąć jak najwięcej cieczy. Na tym etapie próbki można przechowywać w -20 °C i kontynuować procedurę w późniejszym terminie.</li>
	<li>Do każdej probówki dodać 15 μl 2x buforu do próbek Laemmli, inkubować w 96 °C przez 5 min i wirować przez 10 sec przy 5,0 x g.</li>
	<li>Przeanalizować próbki za pomocą immunoblottingu, używając przeciwciała przeciwko ciężkiemu łańcuchowi klatryny. Oczekiwane wyniki: klatryna wiąże się z GST-vCB, ale nie z GST ani GST-vCBmut. Przeanalizować również próbki metodą SDS-PAGE, aby potwierdzić podobną ilość naniesionych białek fuzyjnych GST.</li>
</ol>
6. Analiza koimmunoprecypitacji
<ol>
	<li>Oznaczyć 3 probówki do mikrowirówki: WT (typ dziki SLA1), sla1AAA oraz sla1Δ, a następnie dodać 1 ml PBS, 30 μl zawiesiny 50% (v/v) proteiny A-Sepharose w buforze A oraz 2 μg przeciwciała królika anty-Sla1p. </li>
	<li>Inkubować w rotatorze w temperaturze pokojowej przez 30 min. </li>
	<li>Przemyć kuleczki dwukrotnie PBS oraz jednokrotnie buforem A zawierającym 1% Triton X-10.</li>
	<li>Dodać 1 ml odpowiednich całkowitych ekstraktów drożdżowych przygotowanych w Części 4: SLA1, sla1AAA oraz sla1Δ. Inkubować w rotatorze przez 1 h w temperaturze 4 °C. </li>
	<li>Wirować przez 10 sec przy 5,0 x g w celu osadzenia kuleczek, odlać nadosad, a następnie szybko przemyć kuleczki 3 razy buforem A zawierającym 0,1% Triton X-10 oraz raz samym buforem A. </li>
	<li> ponownie odwirować kuleczki i za pomocą końcówki do nakładania próbek na żel usunąć jak najwięcej cieczy. Na tym etapie próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C i kontynuować procedurę w późniejszym terminie.</li>
	<li>Dodać 15 μl 2x buforu do próbek Laemmli do każdej probówki, inkubować w temperaturze 96 °C przez 5 min i wirować przez 10 sec przy 5,0 x g. </li>
	<li>Próbki poddać analizie metodą immunoblottingu z użyciem przeciwciała przeciwko ciężkiemu łańcuchowi klatryny. Oczekiwane wyniki: klatryna współimmunoprecypituje z Sla1p typu dzikiego, ale nie z sla1AAA ani w próbce sla1Δ.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig1.jpg" alt="Lokalizacja białka SLA1, obraz mikroskopowy; time-lapse dynamiki białka podczas podziału komórki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rycina 1. Analiza adaptora klatrynowego Sla1p w miejscach endocytozy za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek. Pojedyncza klatka (po lewej) z filmu oraz odpowiadające jej kymografy (po prawej) komórek drożdży wykazujących ekspresję Sla1-GFP lub sla1AAA-GFP z mutacją LLDLQ na AAALQ. Zarówno Sla1-GFP typu dzikiego, jak i mutant był wyrażany z endogennego locus SLA1. Miejsca endocytozy widoczne są jako jasne punkty rozmieszczone na obwodzie komórki (obrazy po lewej). Obszar między białymi liniami odpowiada regionowi, z którego wygenerowano kymografy. Filmy nagrywano z prędkością 1 klatka/sek. Zwróć uwagę na dłuższy czas życia Sla1-GFP u mutanta LLDLQ na AAALQ (sla1AAA) w porównaniu z typem dzikim (SLA1).
<img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig2.jpg" alt="Analiza białek; schemat immunoblottingu; detekcja ciężkiego łańcucha klatryny; białka fuzyjne GST." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Fizyczna interakcja między klatryną a wariantem sekwencji clathrin box białka Sla1p. Białko GST połączone z fragmentem Sla1p aa798-813 zawierającym sekwencję LLDLQ (GST-vCB), odpowiadający mutant AAALQ (GST-vCBmut) lub samo białko GST (GST) zostały związane z ziarnami sepharozy z glutationem i inkubowane z ekstraktem cytozolowym z komórek drożdży typu dzikiego. Powiązane białka wyeluowano i przeanalizowano za pomocą immunoblottingu (IB) w kierunku ciężkiego łańcucha klatryny.

<ol><li>Mellman, I., Warren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+taken%3A+past+and+future+foundations+of+membrane+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The road taken: past and future foundations of membrane traffic.</a> Cell. 100, 99-112 (2000).</li>
<li>Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+assembly+and+endocytosis%3A+from+yeast+to+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).</li>
<li>Conner, S. D., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+portals+of+entry+into+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated portals of entry into the cell.</a> Nature. 422, 37-44 (2003).</li>
<li>Bonifacino, J. S., Traub, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+for+sorting+of+transmembrane+proteins+to+endosomes+and+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes.</a> Annu Rev Biochem. 72, 395-447 (2003).</li>
<li>Ungewickell, E. J., Hinrichsen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis%3A+clathrin-mediated+membrane+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocytosis: clathrin-mediated membrane budding.</a> Curr Opin Cell Biol. 19, 417-425 (2007).</li>
<li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu Rev Biochem. 78, 857-902 (2009).</li>
<li>Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Clathrin.</a> Annu Rev Biochem. 69, 699-727 (2000).</li>
<li>Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., Wakeham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+basket+weaving%3A+formation+and+function+of+clathrin-coated+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 517-568 (2001).</li>
<li>Owen, D. J., Collins, B. M., Evans, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptors+for+clathrin+coats%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptors for clathrin coats: structure and function.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 153-191 (2004).</li>
<li>Dell'Angelica, E. C., Klumperman, J., Stoorvogel, W., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+AP-3+adaptor+complex+with+clathrin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Association of the AP-3 adaptor complex with clathrin.</a> Science. 280, 431-434 (1998).</li>
<li>Dell'Angelica, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-binding+proteins%3A+got+a+motif%3F+Join+the+network%21%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clathrin-binding proteins: got a motif? Join the network!</a> Trends Cell Biol. 11, 315-318 (2001).</li>
<li>Holtzman, D. A., Yang, S., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic-lethal+interactions+identify+two+novel+genes%2C+SLA1+and+SLA2%2C+that+control+membrane+cytoskeleton+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 122, 635-644 (1993).</li>
<li>Howard, J. P., Hutton, J. L., Olson, J. M., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sla1p+serves+as+the+targeting+signal+recognition+factor+for+NPFX%281%2C2%29D-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sla1p serves as the targeting signal recognition factor for NPFX(1,2)D-mediated endocytosis.</a> J. Cell. Biol. 157, 315-326 (2002).</li>
<li>Mahadev, R. K., Pietro, S. M. D. i, Olson, J. M., Piao, H. L., Payne, G. S., Overduin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Sla1p+homology+domain+1+and+interaction+with+the+NPFxD+endocytic+internalization+motif%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of Sla1p homology domain 1 and interaction with the NPFxD endocytic internalization motif.</a> EMBO J. 26, 1963-1971 (2007).</li>
<li>Pietro, S. M. D. i, Cascio, D., Feliciano, D., Bowie, J. U., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+clathrin+adaptor+function+in+endocytosis%3A+A+novel+role+for+the+SAM+domain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of clathrin adaptor function in endocytosis: A novel role for the SAM domain.</a> EMBO J. 29, 1033-1044 (2010).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+design+for+the+clathrin-+and+actin-mediated+endocytosis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery.</a> Cell. 123, 305-320 (2005).</li>
<li>Longtine, M. S., McKenzie, A., Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P., Pringle, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14, 953-9561 (1998).</li>
<li>Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C., Philippsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+HIS3+marker+and+GFP+reporter+modules+for+PCR-targeting+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 13, 1065-1075 (1997).</li>
<li>Robinson, J. S., Klionsky, D. J., Banta, L. M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+sorting+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+isolation+of+mutants+defective+in+the+delivery+and+processing+of+multiple+vacuolar+hydrolases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein sorting in Saccharomyces cerevisiae: isolation of mutants defective in the delivery and processing of multiple vacuolar hydrolases.</a> Mol Cell Biol. 8, 4936-4948 (1988).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J. Bacteriology. 153, 163-168 (1983).</li>
<li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).</li>
<li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122, 19-27 (1989).</li>
<li>Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPFXD-mediated+endocytosis+is+required+for+polarity+and+function+of+a+yeast+cell+wall+stress+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor.</a> Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Pęcherzyki powlekane klatryną (CCV) uczestniczą w endocytozie oraz transporcie z sieci trans-Golgi i endosomów, które są konserwatywnymi szlakami o fundamentalnym znaczeniu dla biologii komórki eukariotycznej. Metody opisane w niniejszej pracy są przydatne do badania mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za formowanie się CCV, w szczególności oddziaływań między białkami adaptorowymi a klatryną. Testy powinowactwa białek fuzyjnych GST oraz analizy koimmunoprecypitacji umożliwiają sprawdzenie fizycznego powią...

<table><tbody><tr><td>zestaw do mutagezy celowanej QuickChange-XL</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>koktajl inhibitorów proteaz</td><td>Sigma</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

badania in vivo i in vitro nad oddziaływaniem adaptora z klatryną

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Główna ścieżka endocytozy rozpoczyna się od tworzenia pęcherzyków powleczonych klatryną (CCVs), które transportują ładunek z powierzchni komórki do endosomów1-6. Pęcherzyki CCVs charakteryzują się poliedryczną siecią klatryny, która otacza błonę pęcherzyka i służy jako rusztowanie mechaniczne. Powłoki klatryny są montowane podczas formowania pęcherzyka z pojedynczych triskelionów klatryny, czyli rozpuszczalnej formy klatryny składającej się z trzech podjednostek łańcucha ciężkiego i trzech podjednostek łańcucha lekkiego7,8. Ponieważ triskelion nie posiada zdolności do bezpośredniego wiązania się z błoną, kluczowe znaczenie mają adaptory wiążące klatrynę, które łączą powstającą sieć klatryny z błoną poprzez asocjację z lipidami i/lub białkami błonowymi9. Adaptory odpowiadają również za pakowanie ładunku białek transbłonowych, takich jak receptory, oraz mogą oddziaływać ze sobą i z innymi komponentami mechanizmu formowania CCV9.
Opisano ponad dwadzieścia adaptorów klatryny; niektóre z nich biorą udział w endocytozie zależnej od klatryny, a inne lokalizują się w sieci trans-Golgi lub w endosomach9. Z wyjątkiem HIP1R (Sla2p u drożdży), wszystkie znane adaptory klatryny wiążą się z domeną N-końcową typu śmigła (propeller) ciężkiego łańcucha klatryny9. Adaptory klatryny są białkami modularnymi, składającymi się z pofałdowanych domen połączonych nieustrukturyzowanymi, elastycznymi łącznikami. W obrębie tych regionów łącznikowych krótkie motywy wiążące pośredniczą w oddziaływaniach z domeną N-końcową klatryny lub innymi komponentami aparatu tworzenia pęcherzyków9. Zdefiniowano dwa odrębne motywy wiążące klatrynę: clathrin-box oraz W-box9. Konsensusowa sekwencja clathrin-box została pierwotnie zdefiniowana jako L[L/I][D/E/N][L/F][D/E]10, lecz w późniejszym czasie odkryto jej warianty11. W-box odpowiada sekwencji PWxxW (gdzie x oznacza dowolny aminokwas).
Sla1p (Synthetic Lethal with Actin binding protein-1) został pierwotnie zidentyfikowany jako białko związane z aktyną i jest niezbędny dla prawidłowej struktury i dynamiki cytoszkieletu aktynowego w miejscach endocytozy w komórkach drożdży12. Sla1p wiąże również endocytyczny sygnał sortowania NPFxD i ma kluczowe znaczenie dla endocytozy ładunków posiadających sygnał NPFxD13,14. Niedawno wykazano, że Sla1p wiąże klatrynę poprzez motyw podobny do skrzynki klatrynowej (clathrin box), LLDLQ, nazywany wariantową skrzynką klatrynową (vCB), i pełni funkcję endocytycznego adaptora klatryny15. Ponadto Sla1p stał się powszechnie stosowanym markerem otoczki endocytycznej w badaniach z wykorzystaniem fluorescencyjnej mikroskopii komórek żywych16. W niniejszej pracy wykorzystujemy Sla1p jako model do opisu podejść w badaniach nad oddziaływaniami między adapterem a klatryną. Skupiamy się na metodach fluorescencyjnej mikroskopii komórek żywych, GST-pull down oraz ko-immunoprecypitacji.

Endocytoza zależna od klatryny opiera się na białkach adaptorowych, które koordynują selekcję ładunku i montaż otoczki klatrynowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy procedury służące do badania fizycznych oddziaływań między białkami adaptorowymi a klatryną oraz metody obrazowania żywych komórek, wykorzystując jako model drożdżowe białko adaptorowe endocytozy Sla1p.

Badania in vivo i in vitro nad oddziaływaniem adaptora z klatryną

Główna ścieżka endocytozy rozpoczyna się od tworzenia pęcherzyków powłokowanych klatryną (CCVs), które transportują ładunek z powierzchni komórki do endosomów1-6. CCVs ...

Podczas endocytozy zależnej od klatryny wielościenna sieć klatryny jest łączona z białkami błonowymi lub lipidami za pomocą białek adaptacyjnych wiążących klatrynę, takich jak Sla1. Sla1 wiąże klatrynę poprzez wariant pudełka klatrynowego (variant clathrin box, VCB). W tym filmie zastosowano trzy metody analizy oddziaływań klatryny z Sla1. Po pierwsze, komórki drożdży wykazujące ekspresję natywnego Sla1 oraz mutantów Sla1 z mutacją VCB, znakowanych GFP, są obrazowane przy użyciu konfokalnej mikroskopii dyskowej.Następnie analizuje się filmy poklatkowe, aby określić wpływ mutacji na kinetykę endocytozy. Po drugie, z komórek typu dzikiego przygotowuje się wyciągi cytozolowe drożdży jako źródło klatryny, a następnie przeprowadza testy pull-down z białkiem fuzyjnym G-S-T-V-C-B, aby zbadać oddziaływanie klatryny z VCB in vitro. Po trzecie, przygotowuje się ekstrakty całkowite z komórek drożdży wykazujących ekspresję natywnego VCB oraz mutantów VCB.Wykonuje się precypitację SLA one i klatryny, aby zbadać wpływ mutacji na powinowactwo wiązania SLA one do klatryny in vivo. Ostatecznie uzyskane dane wykazują, że mutacja VCB opóźnia endocytozę i prowadzi do utraty wiązania SLA one z klatryną

in-vivo-and-in-vitro-studies-of-adaptor-clathrin-interaction

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In vivo i in vitro badania interakcji adaptor-klatryna

Przepuszczalny przez błony komórkowe czynnik sieciujący DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizuje przejściowe i nietrwałe oddziaływania in vivo, co umożliwia ich izolację przy użyciu rygorystycznych technik oczyszczania kompleksów białkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy technikę sieciowania komórek hodowlanych, a następnie izolacji kompleksów białkowych metodą immunoprecypitacji.

Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Subkomórkowa lokalizacja białek jest kluczowa dla określenia czasowo-przestrzennej regulacji sygnalizacji komórkowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy bimolekularną komplementację fluorescencji (BiFC) jako prostą metodę monitorowania przestrzennych oddziaływań białek w komórce.

Bimolekularna komplementacja fluorescencyjna

Wykazano, że regulator przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR), będący nabłonkowym kanałem chlorkowym, oddziałuje z różnymi białkami i reguluje istotne procesy komórkowe; wśród nich dobrze udokumentowano oddziaływania pośredniczone przez motyw PDZ białka CFTR. Niniejszy protokół opisuje opracowane przez nas metody składania kompleksu sygnalizacyjnego makromolekularnego CFTR zależnego od domeny PDZ in vitro.

In vitro analiza makromolekularnych kompleksów sygnałowych CFTR zależnych od domen PDZ

Opisano metodę wysokoprzepustowego screeningu służącą do identyfikacji nowych kompetentnych sygnałowo receptorów błonowych. Metoda ta nadaje się do automatyzacji na dużą skalę i pozwala na przewidywanie wiązania białek in vivo oraz subkomórkowej lokalizacji kompleksów białkowych w komórkach ssaków.

Przepływ pracy obrazowania wysokotreściowego do badania kompleksów sygnalizacyjnych Grb2 za pomocą klonowania ekspresyjnego

Endocytoza za pośrednictwem klatryny, szybki i bardzo dynamiczny proces internalizuje wiele białek, w tym receptory sygnałowe. Opisany tutaj protokół bezpośrednio wizualizuje kinetykę poszczególnych zdarzeń endocytarnych. Ma to zasadnicze znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób rdzeniowi członkowie maszynerii endocytarnej koordynują się ze sobą i jak ładunek białka wpływa na ten proces.

Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF

Oligomeryzacja receptora ryanodyny, homo-tetramerycznego kanału jonowego pośredniczącego w uwalnianiu Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów, jest krytyczna dla skurczu mięśnia szkieletowego i sercowego. W tym artykule przedstawiono komplementarne metody in vivo i in vitro do wykrywania samoasocjacji białek i wyznaczania stechiometrii homo-oligomerów.

Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Tutaj opisujemy procedurę wizualizacji i ilościowego określania z dużą czułością endogennych interakcji między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami w komórkach stałych. Protokół zawiera zoptymalizowany test ligacji zbliżeniowej in situ ukierunkowany na receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu / białko regulowane glukozą 75 / zależny od napięcia kanał anionowy / kompleks cyklofiliny D na granicy faz błony związanej z mitochondriami.

Badanie interakcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach utrwalonych

Wczesne funkcje endosomów zależą od polimeryzacji F-aktyny. W tym miejscu opisujemy oparty na mikroskopii test in vitro, który odtwarza zarodkowanie i polimeryzację F-aktyny na wczesnych błonach endosomalnych w probówkach, czyniąc w ten sposób tę złożoną serię reakcji podatną na manipulacje biochemiczne i genetyczne.

In vitro Polimeryzacja F-aktyny na wczesnych endosomach

Prezentowany tutaj jest protokół do określania oligomerycznego stanu białek błonowych, który wykorzystuje natywny system nanocząstek błony komórkowej w połączeniu z mikroskopią elektronową.

System natywnych nanocząstek błony komórkowej do analizy interakcji białko-białko błonowe

W protokole przedstawiono metodę kowalencyjnego przyłączania biotyny do białek in vivo w oparciu o ich bliskość do ligazy biotyny połączonej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie białek za pomocą kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji białkowych.

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Poznaj metody badania interakcji białka adaptorowego Sla1p z klathryną w komórkach drożdży. Wykorzystaj mikroskopię konfokalną i testy GST pull-down do analizy endocytozy zależnej od klathryny.

Badania in vivo i in vitro nad oddziaływaniem adaptora z klatryną

Przeglądaj więcej filmów