Manipulacja komórkami płytki nerwowej poprzez nanoiniekcję in utero w embrionalnym modelu myszy

Zabezpiecz znieczuloną ciężarną mysz z odsłoniętą macicą zawierającą zarodki przed neurulacją. Na tym etapie płytka nerwowa jest otwarta i bezpośrednio wystawiona na działanie płynu owodniowego.

Umieść wybrane zarodki na szalce Petriego z elastyczną membraną, aby je ustabilizować. Zabezpiecz zarodki i zastosuj sól fizjologiczną w celu nawodnienia.

Ustaw sondę ultradźwiękową nad zarodkiem i zmierz średnicę jamy owodniowej, aby obliczyć optymalną objętość wstrzyknięcia.

Umieścić igłę do nanoiniekcji zawierającą roztwór lentiwirusowy o wysokim mianie nad docelowym zarodkiem pod kątem zbliżonym do prostopadłego.

Wstrzyknąć precyzyjnie małą objętość do jamy owodniowej, delikatnie wycofać igłę i wyjąć sondę ultradźwiękową.

Delikatnie wepchnij zarodki z powrotem do wnętrza myszy.

Wstrzyknięty lentiwirus łączy się z komórkami płytki nerwowej, uwalniając swój materiał genetyczny, który ulega odwrotnej transkrypcji do DNA i jest integrowany z genomem gospodarza.

Umożliwia to stabilną manipulację genami w komórkach płytki nerwowej, wspierając potencjalne zastosowania terapeutyczne.

Za pomocą kleszczy przytrzymaj tkankę między zarodkami i ostrożnie wyciągnij oba rogi macicy z brzucha. Policz i ponumeruj zarodki, od jajnika do szyjki macicy lub od szyjki macicy do jajnika, po obu stronach.

Następnie wilgotnym wacikiem delikatnie wepchnij wszystkie zarodki z powrotem do jamy brzusznej, z wyjątkiem pierwszych trzech do wstrzyknięcia. Następnie umieść kroplę PBS na elastycznej membranie przyklejonej do okrągłego środkowego otworu dostępnej w handlu zmodyfikowanej szalki Petriego i trzymaj ją bezpośrednio nad zarodkami. Włóż zamknięte kleszcze do nacięcia gumki, a następnie zwolnij kleszcze, aby otworzyć elastyczne nacięcie, upuszczając płyn na zarodki.

Za pomocą kleszczy przeciągnij przez gumkę odcinek macicy odpowiadający trzem zarodkom i delikatnie przyłóż szalkę Petriego na brzuchu myszy. Za pomocą czterech glinianych nóżek zabezpiecz i przymocuj szalkę Petriego nad brzuchem, aby zmniejszyć nacisk na mysz, a także zmniejszyć wrażliwość obrazowania na oddech i bicie serca myszy. Następnie, za pomocą kleszczy i wilgotnego wacika, wyreguluj macicę i gumkę, aby upewnić się, że gumka jest uszczelniona wokół skóry myszy, zapobiegając wyciekowi PBS.

Następnie, aby unieruchomić macicę, dociśnij cylinder z gliny modelarskiej po prawej stronie zarodków lub macicy i dodaj PBS do szalki Petriego, aż zarodki i macica zostaną całkowicie pokryte PBS. Aby ułatwić rejestrację wstrzyknięć, zanurz sondę ultradźwiękową w PBS i wyreguluj mysz lub stół chirurgiczny tak, aby pierwszy zarodek był wyrównany z sondą ultrasonograficzną. Przeskanuj wszystkie trzy zarodki i sprawdź jamy owodniowe.

Następnie za pomocą aparatu USG należy zmierzyć średnicę jamy owodniowej w celu określenia odpowiedniej objętości iniekcji. Za pomocą sterownika wtrysku ustaw określone objętości wtrysku i prędkość wtrysku na wolną, z szybkością wtrysku 23 nanolitrów na sekundę. Po opuszczeniu igły do PBS, za pomocą głównych kół w systemie szynowym, naciśnij przycisk Empty na sterowniku nanowtryskiwacza, aż płyn dotrze do końcówki igły.

Następnie wyjąć igłę z PBS i nacisnąć przycisk Inject, aby sprawdzić, czy wypłynęła kropla o przybliżonej pożądanej objętości. Ponownie opuść igłę do PBS i przesuń nanowstrzykiwacz za pomocą koła płaskiego Y na mikromanipulatorze, aby wyrównać igłę z sondą ultradźwiękową i zarodkiem. Wyreguluj kąt igły za pomocą pokrętła kąta wstrzyknięcia, aby zapewnić prawie prostopadły kąt wstrzyknięcia w stosunku do ściany macicy.

Następnie, za pomocą koła iniekcyjnego na mikromanipulatorze, jednym ruchem wprowadzić igłę do jamy owodniowej. Jeśli końcówka igły zniknie z obrazu ultrasonograficznego, przesuń sondę do przodu lub do tyłu, aby przywrócić ostrość igły. Następnie wstrzyknij żądaną objętość, naciskając przycisk Inject odpowiednią liczbę razy.

Po wstrzyknięciu wymaganej objętości należy odczekać od 5 do 10 sekund przed wycofaniem igły jednym delikatnym ruchem.

Następnie wyjmij sondę ultradźwiękową i igłę z PBS za pomocą mikromanipulatora, obracając igłę od operatora, aby uniknąć uszkodzeń i obrażeń.

Za pomocą kleszczy umieść pierwszy i drugi zarodek z powrotem w jamie brzusznej, delikatnie przepychając je przez gumkę.

Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków z optymalnymi jamami owodniowymi, delikatnie wepchnij zarodki i macicę z powrotem do brzucha myszy.