Manipulacja optogenetyczna obwodów neuronowych w celu przejścia ze snu do czuwania u myszy

Zabezpiecz znieczuloną mysz z odsłoniętą czaszką w stereotaktycznej ramie.

Jądro łożyska mózgu prążkowia końcowego (BNST) zawiera neurony transdukowane wirusowo, wyrażające światłoczułe kanały kationowe.

Wywierć otwory w czaszce, włóż światłowody i zabezpiecz je podtrzymującymi i cementem dentystycznym.

Wywierć dodatkowe otwory, aby ustawić zespół zawierający elektrody elektroencefalograficzne (EEG) i elektromiograficzne (EMG) i zabezpiecz je klejem.

Odsłoń mięśnie szyi, aby wprowadzić przewody elektrody EMG, a następnie pozwól na regenerację.

Podłącz mysz do systemu nagrywającego, umieść ją w komorze eksperymentalnej i pozwól jej spać.

Dostarczaj światło przez światłowód, aby aktywować wrażliwe na światło kanały kationowe, wyzwalając napływ kationów, który generuje potencjały czynnościowe.

Sygnały rozchodzą się do regionów regulujących sen i promują czuwanie.

Rejestruj sygnały EEG, aby monitorować aktywność mózgu i sygnały EMG, aby wykrywać aktywność mięśni, aby obserwować przejście ze snu do czuwania.

W przypadku elektroencefalogramu lub EEG i elektromiogramu lub EMG, implantacji elektrod, najpierw dwa druty ze stali nierdzewnej, z których usunięto jeden milimetr izolacji z obu końców, do elektrod EMG i umieść środek elektrod na bregmie. Następnie zaznacz położenie każdej elektrody EEG.

Aby określić położenie implantu światłowodowego, przymocuj tuleję światłowodową do manipulatora i obróć ramię manipulatora pod kątem plus minus 30 stopni względem linii poziomej. Połóż końcówkę światłowodu na bregmie i zapisz współrzędne. Przesuń końcówkę do docelowej linii wprowadzania i zaznacz pozycję na czaszce oraz pozycję kotwiącej obok miejsca włożenia.

Użyj wiertła dentystycznego, aby wywiercić czaszkę w każdym miejscu i użyj manipulatora, aby delikatnie wprowadzić światłowód, aż sięgnie powyżej BNST. Skuwka powinna spoczywać na pozostałej czaszce. Przymocuj włókno do czaszki za pomocą kotwiącej, uważając, aby nie złamać opony twardej ani nie uszkodzić żadnej tkanki.

Następnie przykryj włókno i przykręć fotoutwardzalnym cementem dentystycznym. Następnie wywierć otwory na elektrody EEG/EMG i włóż końcówkę pierwszej elektrody do jednego otworu. Trzymając implant jedną ręką, nałóż klej cyjanoakrylowy na przestrzeń między czaszką a elektrodą i włóż elektrodę do końca, uważając, aby nie uszkodzić żadnej tkanki.

Po umieszczeniu wszystkich elektrod należy pokryć obwód elektrod i światłowodów dodatkowym klejem cyjanoakrylowym i przyspieszaczem cyjanoakrylanu, aby uniknąć powodowania przerw w strefach łączenia tulejki z optycznym i elektrody z przewodem ołowianym. Teraz odsłoń mięśnie szyi i włóż przewody elektrody EMG pod mięsień. Dostosuj długość elektrody EMG tak, aby zmieściła się tuż pod mięśniami karkowymi i wypełnij implanty większą ilością kleju cyjanoakrylowego i przyspieszacza.

Następnie umieść mysz na podkładce grzewczej z monitorowaniem aż do pełnej rekompensaty. Do monitorowania EEG/EMG podczas fotowzbudzenia docelowych neuronów, najpierw użyj skalara do regulacji intensywności lasera i użyj skuwki, aby przywiązać końcówkę laserowego do nieużywanego światłowodu. Upewnij się, że na styku między światłowodem a nie ma miejsca.

Po 20 minutach wyemituj rozgrzany laser do kontrolera intensywności i dostosuj intensywność do 10 miliwatów na milimetr kwadratowy. Ustaw czas trwania impulsu świetlnego na 10 milisekund, okres odpoczynku na 40 milisekund, cykl na 20, a powtarzanie na 20. Zmień tryb lasera na logikę tranzystorową i potwierdź, że impulsy świetlne są emitowane ze światłowodu sterowanego przez regulator wzoru.

Podłącz wszczepioną elektrodę i adapter, a następnie zakryj złącze materiałem nieprzepuszczalnym dla światła, aby zapobiec wyciekowi lasera. A kiedy laser będzie gotowy, przenieś myszy do komory eksperymentalnej w celu rejestracji EEG/EMG. Aby ocenić opóźnienie do czuwania spowodowane nieszybkimi ruchami gałek ocznych lub snem z szybkimi ruchami gałek ocznych, ogranicz czas nagrywania i zoptymalizuj czas przyrostu miejsca i pozwól myszom swobodnie poruszać się w komorze eksperymentalnej przez co najmniej godzinę.

W okresie eksperymentalnym monitoruj sygnały EEG i EMG na tym samym ekranie rejestracji. Oceń stan myszy jako stan czuwania, sen bez szybkich ruchów gałek ocznych lub sen z szybkimi ruchami gałek ocznych, używając regulatora wzmocnienia dla każdej fali, aby ułatwić rozróżnienie każdego stanu. Aby zmierzyć opóźnienie snu bez szybkich ruchów gałek ocznych do czuwania, obserwuj stabilny sen bez szybkich ruchów gałek ocznych przez 40 sekund, a następnie włącz generator wzorców do stymulacji fotograficznej i potwierdź emisję lasera do wszczepionych światłowodów.

Następnie rejestruj sygnały EEG/EMG do momentu, gdy stan snu zmieni się w stan czuwania.