Name: Hodowla pierwotnych neuronów ruchowych i czuciowych w określonych pożywkach na elektroprzędzonych rusztowaniach z nanowłókien poli-L-laktydowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 3 s
Description: Poznaj metodę hodowli pierwotnych neuronów szczura na wyrównanych rusztowaniach z nanowłókien poli-L-laktydowych. Technika ta umożliwia badanie kierunkowanego wzrostu neuritów w kontekście neuroregeneracji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NIH K08 EB003996

1. Roztwór prziądkowy kwasu poli-L-mlekowego (PLLA)
<ol>
	<li>Rozpuścić 0,4 g PLLA w 9 mL chloroformu, mieszając przy niskiej temperaturze.</li>
	<li>Dodać 1 mL dimetyloformamidu do roztworu, aby uzyskać końcowe stężenie 4% PLLA (w/v) w mieszaninie chloroform:DMF 9:1 (v/v).</li>
	<li>Przenieść roztwór do strzykawki polipropylenowej lub szklanej z tępą metalową igłą o rozmiarze 23ga.</li>
</ol>
2. Przygotowanie podłoża rotacyjnego1
<ol>
	<li>Przygotuj 8% (w/v) roztwór PLGA (kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego) o proporcjach 85:15 w chloroformie, mieszając go przy niskiej temperaturze.</li>
	<li>Pokryj czyste szklane szkiełka nakrywki warstwą PLGA, pokrywając powierzchnię każdego szkiełka roztworem PLGA. Pozostaw PLGA do wyschnięcia w postaci cienkiej warstwy (ok. 30 min).</li>
</ol>
3. Elektroprzędzenie2
<ol>
	<li>Przymocuj szkiełka przedmiotowe pokrywowe powlekone PLGA do kolektora za pomocą przewodzącej taśmy węglowej. W przypadku włókien uporządkowanych kolektorem jest koło napędzane silnikiem. Dla włókien przypadkowych kolektorem jest nieruchoma płyta.</li>
	<li>Umieść strzykawkę w pompie tak, aby końcówka znajdowała się 20 cm od koła kolektora. Ustaw pompę na około 2 mL/hr, a w przypadku użycia koła ustaw silnik na 300-40 RPM. Jeśli to możliwe, przyłóż napięcie polaryzacyjne DC -2 kV do kolektora i +15 kV do metalowej końcówki. W przypadku braku dostępu do zasilacza bipolarnego uziem kolektor.</li>
	<li>Włókna będą wytryskiwać z końcówki strzykawki i osadzać się na obracającym się kole. Kontynuuj przędzenie aż do uzyskania pożądanej gęstości włókien. Okresowo przecieraj metalową końcówkę ręcznikiem papierowym przymocowanym do nieprzewodzącego pręta, aby zapobiec zatykaniu się końcówki.</li>
</ol>
4. Tworzenie rowka (moating)1
<ol>
	<li>Po zakończeniu przędzenia należy utworzyć „fosę” wokół próbek elektroprzędzonych, naniosząc pipetą linię PLGA wokół obwodu szkiełka nakrywkowego. Pozostawić PLGA do wyschnięcia. Pozwoli to zachować orientację włókien podczas hodowli.</li>
</ol>
5. Powlekanie białkiem
<ol>
	<li>Włókna otrzymane metodą elektroprzędzenia oraz szklane kontrolki muszą zostać pokryte białkiem przed hodowlą komórek. Podłoża należy zanurzyć w roztworze białka na co najmniej jedną godzinę, a następnie odessać nadmiar roztworu i kontynuować aspirację do czasu wyschnięcia podłoży. Możliwe roztwory białek to: PLL (poli-L-lizyna) (10 µg/ mL), laminina (25 µg/ mL) lub fibronektyna (50 µg/ mL). W przypadku zastosowania PLL podłoża należy przepłukać w sterylnej wodzie i dwukrotnie wysuszyć po wstępnym pokryciu białkiem.</li>
</ol>
6. Pozyskiwanie zarodków szczura w 15. dniu embrionalnym (E15)3
*Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, zatwierdzonymi przez Komitet ds. Wykorzystania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Michigan.
<ol>
	<li>Przygotowanie: Sprawdź, czy zwierzę jest w ciąży. Rozmroź 3 mL trypsyny, 3 mL FBS i podgrzej butelkę medium L15. Wypal pipetę Pasteura. Zdezynfekuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w 70% etanolu przez 30 min.</li>
	<li>Przygotuj i podgrzej pożywkę do wysiewu (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Eutanazja: Wykonaj zastrzyk domięśniowy (IP) z ketaminy/ksylazyny. Odczekaj 10-15 minut i sprawdź brak odruchu rogówkowego oraz odruchu cofania łapy. Po ustąpieniu odruchów wykonaj zastrzyk wewnątrzsercowy (IC) z pentobarbitalu (FatalPlus).</li>
	<li>Unieś skórę brzucha. Przetnij skórę i warstwy mięśniowe, aby odsłonić jamę brzuszną. Zlokalizuj macicę i oddziel ją na poziomie szyjki macicy i jajników.</li>
	<li>Usuń embriony z macicy za pomocą nożyczek i niezwłocznie umieść je w ciepłym medium L15. (Wszystkie kolejne procedury należy przeprowadzać pod mikroskopem dissectingowym; embriony i wypreparowane pępowiny powinny być przez cały czas zanurzone w ciepłym medium L15). Oddziel głowy embrionów, zaciskając pęsetę w okolicy podżuchownej oraz poniżej kości potylicznej czaszki.</li>
</ol>
7. Disekcja3
<ol>
	<li>Ułożyć zarodek na boku. Chronić rdzeń kręgosłupa jedną pęsetą, podczas gdy drugą usuwać kończyny i narządy jamy brzusznej.</li>
	<li>Obrócić zarodek i unieruchomić go jedną pęsetą. Przeciąć wzdłuż zarodka, od szyi do ogona, aż cały rdzeń zostanie odsłonięty.</li>
	<li>Ostrożnie chwycić koniec rdzenia i pociągnąć go w kierunku ogona, aby go usunąć. Rdzeń zostanie oddzielony wraz z przytwierdzoną błoną i zwojami korzeni grzbietowych (DRG).</li>
	<li>W przypadku planowania hodowli eksplantów DRG lub dysocjowanych neuronów sensorycznych, odciąć DRG od rdzenia i przenieść je do nowej szalki z ciepłym medium L15.
	<ol>
		<li>W przypadku hodowli eksplantów DRG przejść do kroku 10.2</li>
		<li>W przypadku hodowli dysocjowanych neuronów sensorycznych przejść do kroku 9</li>
		<li>W przypadku hodowli neuronów ruchowych DRG zostaną usunięte wraz z błoną w kroku 7.5</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć błonę z rdzenia kręgosłupowego, chwytając ją na górnym końcu rdzenia i odrywając w dół, analogicznie do zdejmowania długiej skarpetki. Powtórzyć czynność dla wszystkich zarodków, a następnie pociąć rdzenie na małe (2-3 mm) kawałki.</li>
</ol>
8. Przetwarzanie neuronów ruchowych (MN)5,6,7 
<ol>
	<li>Przenieś posiekane sznury pępowinowe oraz pożywkę L15 do probówki stożkowej i wiruj przy 10 RPM przez 2-3 min w celu sfragmentowania i osadzenia kawałków tkanek.</li>
	<li>Odlej supernatant i dodaj 3 mL trypsyny do osadu z sznurów. Inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 20 min.</li>
	<li>Dodaj 3 mL FBS do probówki stożkowej i wiruj przy 10 RPM przez 2-3 min, aby ponownie uzyskać osad.</li>
	<li>Odlej supernatant i pokryj wnętrze wypalonej pipety Pasteura FBS.</li>
	<li>Dodaj do probówki stożkowej objętość L15 odpowiadającą jednej pipecie Pasteura, a następnie delikatnie homogenizuj do uzyskania jednorodnego roztworu bez widocznych grudek. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Przygotuj 9% roztwór Optiprep w pożywce L15. Przygotuj jedną probówkę z 3 mL roztworu Optiprep na każde dwa embriony (w przypadku nieparzystej liczby embrionów zaokrąglij liczbę probówek w górę).</li>
	<li>Nanieś zhomogenizowany roztwór na roztwór Optiprep, dzieląc go równomiernie pomiędzy wszystkie probówki. Wiruj probówki przy 200 RPM przez 15 min.</li>
	<li>Ostrożnie pobierz górne 2 mL z każdej probówki i połącz je w probówce stożkowej o pojemności 50 mL. Napełnij probówkę pożywką L15 i wiruj przy 10 RPM przez 5 min, aby wypłukać Optiprep z komórek.</li>
	<li>Odlej supernatant i resuspenderuj komórki w niewielkiej ilości pożywki do hodowli (250-50 µl). Policz komórki, stosując metodę wykluczania błękitu trypanowego w celu zidentyfikowania żywych komórek. Przejdź do kroku 10.1.</li>
</ol>
9. Przetwarzanie neuronów sensorycznych (SN)7
<ol>
	<li>Przenieś wyjęte z rdzeni kręgowych i medium L15 zwoje korzeni grzbietowych (DRG) do probówki stożkowej i wiruj przy 10 RPM przez 2-3 min, aby osadzić fragmenty na dnie.</li>
	<li>Odlej nadsącz i dodaj 3 mL trypsyny do osadu DRG. Inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 10 min.</li>
	<li>Dodaj 3 mL FBS do probówki stożkowej i wiruj przy 10 RPM przez 2-3 min, aby ponownie osadzić komórki.</li>
	<li>Odlej nadsącz i pokryj wnętrze wypalanej pipety Pasteura FBS.</li>
	<li>Dodaj do probówki stożkowej objętość odpowiadającą jednej pipecie Pasteura medium L15, a następnie delikatnie homogenizuj przez pipetowanie, aż roztwór stanie się jednorodny i pozbawiony widocznych grudek. Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Wiruj homogenat przy 100 RPM przez 5 min. Odlej nadsącz i resuspender komórki w niewielkiej ilości pożywki SN do wysiewania (250-50 µl). Policz komórki, stosując metodę wykluczenia błękitu trypanu w celu zidentyfikowania żywych komórek. Przejdź do kroku 10.1.</li>
</ol>
10. Wysiewanie i hodowla
<ol>
	<li>W przypadku hodowli dysocjowanych neuronów czuciowych (SN) lub ruchowych (MN):
	<ol>
		<li>Przykryć podłoża kilkoma kroplami pożywki, a następnie dodać odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej. Dysocjowane komórki należy wysiewać z niską gęstością (25-50 komórek/mm2). Pozostawić komórki do przytwierdzenia na co najmniej jedną godzinę przed całkowitym wypełnieniem studnieków pożywką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku hodowli eksplantów zzęsłów korzeniowych (DRG):
	<ol>
		<li>Przykryć podłoża kilkoma kroplami pożywki, a następnie dodać DRG do pożywki. Rozmieścić DRG tak, aby były równomiernie rozłożone na podłożu (na szkiełku podstawkowym o wymiarach 2x2 mm zmieści się około 4 DRG). Pozostawić DRG do przytwierdzenia na co najmniej 4 h przed całkowitym wypełnieniem studnieków pożywką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowle można utrzymywać do 4 dni bez wymiany pożywki. W przypadku dłuższych hodowli należy przeprowadzać połowiczą wymianę pożywki na pożywkę do dokarmiania. Pożywka do dokarmiania ma taki sam skład jak pożywka do wysiewu, z wyjątkiem L-glutaminy.</li>
</ol>
1. Immunocytochemia1,5,8
<ol>
	<li>Fiksacja komórek: Odessać medium i zastąpić je ciepłym 4% PFA (paraformaldehydem) na 30 min. Następnie przeprowadzić 3x 5-minutowe przemycia w 1x PBS.</li>
	<li>Blokowanie/permeabilizacja: Przygotować roztwór do blokowania i permeabilizacji (1,25% albuminy surowicy bydlęcej w 1X PBS, 0,05% Triton X-10 oraz 2,0% normalnej surowicy koziej). Odessać PBS i nałożyć roztwór do blokowania/permeabilizacji na próbki na 30 minut. Następnie przeprowadzić 1x 5-minutowe przemycie w 1x PBS.</li>
	<li>Przeciwciało pierwszorzędowe: Przygotować pracujący roztwór przeciwciała pierwszorzędowego (10% normalnej surowicy koziej, 1,25% albuminy surowicy bydlęcej, 0,1% Na azide, 0,05% Triton X-10 i uzupełnić do 10 mL przy użyciu 1x PBS). Dodać odpowiednią ilość przeciwciała pierwszorzędowego (patrz Tabela 2). Wyłożyć kilka szalek parafilmem. Na parafilmie dla każdego podłoża umieścić kroplę 20µl pracującego roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Odwrócić podłoża, tak aby spoczywały stroną z komórkami na pracującym roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przez noc (jeśli w pomieszczeniu działa klimatyzacja lub jest szczególnie sucho, w narożniku szalki można dodać kawałek papieru nasączonego wodą, aby zapobiec odparowywaniu roztworu pracującego).</li>
	<li>Przeciwciało wtórne: Zdjąć podłoża z przeciwciał pierwszorzędowych (roztwór pracujący można zebrać, przechowywać w 4°C i użyć ponownie) i przeprowadzić 2x 5-minutowe przemycia w 1x PBS. Nałożyć 20 µl przeciwciała wtórnego rozcieńczonego 1:20 w PBS (również w pozycji odwróconej na szalce wyłożonej parafilmem) na 4 h.</li>
	<li>Zdjąć z przeciwciał wtórnych, a następnie przeprowadzić 2x 5-minutowe przemycia w 1x PBS. Zamontować podłoża na szkiełkach za pomocą Prolong Gold zawierającego DAPI lub innego odpowiedniego barwnika do jąder komórkowych.</li>
</ol>
12. Reprezentatywne wyniki:
Typowa morfologia uporządkowanych i losowych włókien otrzymanych metodą elektroprzędzenia została przedstawiona na Rysunku 1. Stosując ten protokół, zazwyczaj otrzymujemy czystość MN na poziomie &gt;90% neuronów7,8, a hodowle DRG utrzymujemy przez okres do jednego tygodnia bez znaczącego wzrostu fibroblastów. Rysunek 2 przedstawia typowy wygląd MN na szkle i włóknach po 24 godzinach hodowli oraz po immunobarwieniu. Na Rysunku 3 przedstawiono immunobarwione DRG hodowane przez trzy dni na szkle i włóknach.
<img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig1.jpg" alt="Obrazy SEM nanowłókien otrzymanych metodą elektroprzędzenia, włókna uporządkowane kontra przypadkowe, paski skali do analizy strukturalnej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Orientację włókien manipuluje się poprzez wybór kolektora. A.) Włókna uporządkowane naniesione na rotujący kolektor kołowy oraz B.) włókna przypadkowe naniesione na stacjonarny kolektor płytowy. Paski skali = 20 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig2.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej wyrostka neuronalnego; zielona fluorescencja; analiza morfologii komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywne neurony ruchowe barwione przeciwciałem przeciwko TuJ1 (zielony) i DAPI (niebieski) po 24 godzinach hodowli na pokrytych PLL A.) włóknach i B.) szkle. Paski skali = 20 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig3.jpg" alt="Obraz z mikroskopii sieci neuronowej, analiza struktury cytoszkieletu, znakowanie fluorescencyjne, badanie biologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywne zwojezwoje korzeni grzbietowych (DRG) barwione na neurofilamenty (kolor zielony) po 3 dniach hodowli na szkle powlekanym PLL (A) oraz na włóknach powlekanym PLL (B). Paski skali = 200 μm.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Roztwór stokowy:</td>
 <td>pożywka MN:</td>
 <td>pożywka DRG/SN:</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 mg/ml-1 albumina</td>
 <td>12.5 μl</td>
 <td>--</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 mg/ml-1 apo-transferyna</td>
 <td>50 μl</td>
 <td>40 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 μg ml-1 β-estradiol</td>
 <td>2.7 μl</td>
 <td>2.2 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0,1 mg/ml-1 biotyna</td>
 <td>50 μl</td>
 <td>--</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>16 mg/ml-1 katalaza</td>
 <td>8 μl</td>
 <td>--</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 mg/ml-1 D-galaktoza</td>
 <td>50 μl</td>
 <td>--</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 μg ml-1 hydrokortyzon</td>
 <td>3.7 μl</td>
 <td>2.9 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0,63 mg/ml-1 progesteron</td>
 <td>0.5 μl</td>
 <td>--</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>16 mg/ml-1 putrescyna</td>
 <td>50 μl</td>
 <td>--</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 μg ml-1 selen</td>
 <td>3.4 μl</td>
 <td>4.1 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2,5 mg/ml-1 dysmutaza ponadtlenkowa</td>
 <td>50 μl</td>
 <td>--</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>* 500 ng/ml-1 czynnik wzrostu nerwów</td>
 <td>--</td>
 <td>1 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>* 10X PSN</td>
 <td>0,5 mL</td>
 <td>0,5 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>* B27</td>
 <td>1 ml</td>
 <td>1 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>* 2 mM L-glutaminy</td>
 <td>35 μl</td>
 <td>35 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>* Neurobasal</td>
 <td>do 50 ml</td>
 <td>do 50 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Składniki oznaczone gwiazdką (*) należy dodać do pożywki bezpośrednio przed użyciem. Pozostałe składniki można przygotować w formie roztworu zapasowego i przechowywać w temperaturze -20°C do momentu wykorzystania6,7.
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Pierwotna (stężenie)</td>
 <td>Neurony:</td>
 <td>Gleje:</td>
 <td>Fibroblasty:</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>przeciwciało anty-β-tubulina (TuJ1) (1:100)</td>
 <td>✓</td>
 <td>X</td>
 <td>X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anty-neurofilament (1:10)</td>
 <td>✓</td>
 <td>X</td>
 <td>X</td> 
 </tr>
 <tr>
 <td>anty-S-10 (1:250)</td>
 <td>X</td>
 <td>✓</td>
 <td>✓</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anty-NGFR p75 (1:50)</td>
 <td>✓</td>
 <td>✓</td>
 <td>X</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
Tabela 2. Wybór przeciwciała pierwszorzędowego zależy od celów badacza. Powyżej przedstawiono kilka przeciwciał oraz stężenia, które z sukcesem stosowaliśmy w naszym laboratorium. S-10 jest szczególnie użyteczne do identyfikacji komórek Schwanna i/lub wykrywania zanieczyszczeń fibroblastami, należy jednak pamiętać, że musi być stosowane w połączeniu z NGFR p75, aby odróżnić glej od fibroblastów4. Zauważyliśmy również, że NGFR p75 bardzo słabo barwi neuryty, natomiast neurofilament lub TuJ1 są doskonałym wyborem, jeśli celem jest wizualizacja poszczególnych neurytów.

<ol><li>Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+electrospun+PLLA+nanofiber+scaffolds+compatible+with+serum-free+growth+of+primary+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons.</a> Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).</li>
<li>Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+nanofiber+morphologies+using+modulated+electrospinning+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mat.+Res.+Soc.+Symp.+Proc%22%5BJournal%5D)">Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications.</a> Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. , MIT Press. Chapter 19 (1998).</li>
<li>Kameda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+glial+progenitor+markers+p75NTR+and+S100+protein+in+the+developing+mouse+parathyroid+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland.</a> Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).</li>
<li>Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+electrospun+nanofibers+specify+the+direction+of+dorsal+root+ganglia+neurite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).</li>
<li>Vincent, A. M., Mobley, B. C., Hiller, A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-I+prevents+glutamate-induced+motor+neuron+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death.</a> Neurobiol. Dis. 16, 407-416 (2004).</li>
<li>Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor-I+prevents+apoptosis+in+neurons+after+nerve+growth+factor+withdrawal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal.</a> J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).</li>
<li>Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+neuritogenesis+and+maturation+of+primary+spinal+motor+neurons+in+response+to+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers.</a> Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).</li>
<li>Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+parameter+study+for+ultra-fine+fiber+fabrication+via+electrospinning+process%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process.</a> Polymer. 46, 6128-6134 (2005).</li>
<li>Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+highly+aligned+electrospun+poly-L-lactic+acid+fibers+for+nerve+regeneration+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications.</a> J. Neural Eng. 6, (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Protokół ten zawiera kilka krytycznych etapów. Pierwszym z nich jest prawidłowe wytworzenie podłoży z włókien elektroprzędzionych. W mediach ciekłych włókna PLLA, błona PLGA i wał PLGA oddzielą się od szklanego szkiełka nakrywkowe jako jedna całość. Jeśli pominie się PLGA, włókna PLLA nie utworzą płaskiej warstwy – zwiną się w bezużyteczny splot. Dlatego błona PLGA jest stosowana jako odpowiednie podłoże w celu utrzymania wyrównania włókien podczas hodowli. Wał jest dodawany po przędzeniu obu elementów, aby zapewnić trwałe przymocowanie włókien do błony PLGA oraz nadać błonie sztywność strukturalną. Wał służy również jako wygodny uchwyt podczas manipulowania podłożami w trakcie utrwalania, barwienia i montowania. Drugim krytycznym etapem jest tryturacja. Należy dołożyć wszelkich starań, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza. Dodatkowo znacznie wyższe wydajności uzyskiwano, gdy w tym kroku stosowano pipetę wypalaną nad ogniem. Aby wypalić pipetę, należy zapalić palnik Bunsena i przymocować gruszkę do pipety. Przesunąć końcówkę pipety szybko przez płomień 2-3 razy, jednocześnie stale ściskając i puszczając gruszkę – przepływ powietrza przez pipetę pomoże zapobiec całkowitemu zamknięciu się końcówki. Przed użyciem należy sprawdzić końcówkę pipety, aby upewnić się, że otwór jest nadal drożny, a krawędzie wydają się lekko zaokrąglone.
Elektroprzędzenie jest procesem bardzo wszechstronnym; parametry elektroprzędzenia można modyfikować, aby uzyskać włókna o różnych morfologiach. Tan et al. (2005) szczegółowo opisują systematyczne badanie parametrów wpływających na średnicę włókien z PLLA otrzymanych metodą elektroprzędzenia. Wang et al. (2009) przedstawiają szczegółowe badanie parametrów wpływających na orientację włókien z PLLA otrzymanych metodą elektroprzędzenia.

<table><tbody><tr><td>PLLA</td><td>Boehringer Ingeheim</td><td>Resomer L210</td><td></td></tr><tr><td>PLGA 85:15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43471</td><td></td></tr><tr><td>L15</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2289</td><td></td></tr><tr><td>Apoproteina transferryny</td><td>Akorn Inc</td><td>AK8227</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC 23009-0010</td><td></td></tr><tr><td>Galaktoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556</td><td></td></tr><tr><td>Putrescyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E 1132</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Dyzmutaza ponadtlenkowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4636</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PSN</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15640</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Nalge Nunc international</td><td>1680149</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Nalge Nunc international</td><td>1689149</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Accurate Chemical &amp;amp; Scientific Corporation</td><td>2011</td><td></td></tr><tr><td>PLL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F 4759</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TuJ1</td><td>BD Biosciences</td><td>556321</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-neurofilamentowe</td><td>EMD Millipore</td><td>AB1987</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-S100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-NGFR p75</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3908</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Taśma węglowa</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13073-1</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold +DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla pierwotnych neuronów ruchowych i sensorycznych w zdefiniowanych mediach na rusztowaniach z nanowłókien z poli-l-laktydu otrzymanych metodą elektroprzędzenia

The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

Elektroprzędzenie jest techniką wytwarzania włókien w skali mikro- i nanometrycznej. Włókna mogą być elektroprzędzone z różnym stopniem uporządkowania, od silnie wyrównanych po całkowicie losowe. Ponadto włókna mogą być przędzone z różnych materiałów, w tym z polimerów biodegradowalnych, takich jak kwas poli-L-mlekowy (PLLA). Cechy te sprawiają, że włókna otrzymane metodą elektroprzędzenia nadają się do różnorodnych zastosowań w tworzeniu rusztowań w inżynierii tkankowej. Nasza uwaga koncentruje się na wykorzystaniu wyrównanych włókien elektroprzędzonych do regeneracji nerwów. Wykazaliśmy wcześniej, że wyrównane włókna PLLA otrzymane metodą elektroprzędzenia kierują wzrost zarówno pierwotnych neuronów sensorycznych, jak i motorycznych in vitro. Uważamy, że zastosowanie systemu pierwotnych kultur komórkowych jest niezbędne podczas oceny biomateriałów, aby jak najdokładniej modelować rzeczywiste neurony występujące in vivo. W niniejszej pracy opisujemy techniki stosowane w naszym laboratorium do elektroprzędzenia rusztowań włóknistych oraz hodowli eksplantatów zwojów korzeni grzbietowych, a także dysocjowanych neuronów sensorycznych i motorycznych na rusztowaniach elektroprzędzonych. Przedstawione tutaj techniki elektroprzędzenia i/lub hodowli można jednak łatwo dostosować do innych zastosowań.

Uporządkowane włókna otrzymane metodą elektroprzędzenia kierują wzrostem neuronów in vitro i stanowią potencjalny komponent rusztowań do regeneracji nerwów. Opisujemy procedurę przygotowania podłoży z włókien elektroprzędzionych oraz bezsurowiczą hodowlę pierwotnych neuronów sensorycznych (DRG) i ruchowych szczura w stadium E15. Uwzględniono również wizualizację neuronów za pomocą immunocytochemii.

Hodowla pierwotnych neuronów ruchowych i sensorycznych w zdefiniowanych mediach na rusztowaniach z nanowłókien z poli-L-laktydu otrzymanych metodą elektroprzędzenia

Elektroprzędzenie jest techniką wytwarzania włókien o skali od mikro- do nanometrycznej. Włókna można elektroprząść z różnym stopniem uporządkowania, od silnie wyrównanych...

Uporządkowane włókna BUN otrzymane metodą elektroprzędzenia kierują wzrostem neuronów in vitro i stanowią potencjalny komponent rusztowań do regeneracji nerwów. W niniejszym materiale przygotowano rusztowania z włókien BUN i hodowano na nich pierwotne sensoryczne oraz ruchowe neurony szczura. W pierwszej kolejności włókniste rusztowania zostają naniesione metodą elektroprzędzenia na szklane kryształy.Następnie pozyskuje się pierwotne neurony od szczurów w 15. dniu embrionalnym i hoduje je na rusztowaniach z włókien otrzymanych metodą elektroprzędzenia. Pozwala się neuronom przytwierdzić i urosnąć, a następnie utrwala je i barwi przy użyciu technik immunocytochemicznych. Wyniki obrazowania wykazują zmiany w morfologii neuronów hodowanych na włóknach elektroprzędzionych, co wskazuje, że nanotopografia włókien otrzymanych metodą elektroprzędzenia może kierować wzrostem neurytów.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak stosowanie przekształconych linii komórkowych, jest fakt, że pierwotne neurony in vitro znacznie dokładniej odwzorowują zachowanie neuronów in vivo niż komórki przekształcone. Techniki te umożliwiają widzom zastosowanie włókien elektrofunkcyjnych w odniesieniu do innych typów komórek. Alternatywnie, widzowie mogą chcieć wykorzystać hodowlane neurony ruchowe i czuciowe do innych celów badawczych.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ elektroprzędzenie jest procesem wymagającym precyzji, co szczegółowo wyjaśniamy w towarzyszącym artykule wideo. Aby przygotować podłoża z włókien elektroprzędzionych, należy zacząć od przygotowania 8% roztworu kopolimeru kwasu polimlekowego i glikolowego (PLGA) o stosunku 85:15 w chloroformie oraz 4% roztworu poli-L-laktydu (PLLA) w chloroformie, mieszając je przy niskiej temperaturze. Następnie należy pokryć czyste szkiełka nakrywkowe PLGA, rozprowadzając roztwór na powierzchni każdego szkiełka. Należy pozostawić PLGA do wyschnięcia w postaci cienkiej warstwy, co zajmuje około 30 minut.Po wyschnięciu PLGA należy użyć przewodzącej taśmy węglowej, aby przymocować szkiełko nakrywkowe powlekane PLGA albo do napędzanego silnikiem koła w celu wytworzenia wyrównanych włókien, albo do nieruchomej płyty w celu otrzymania włókien losowych. Strzykawkę zawierającą 4% roztwór PLLA należy umieścić w pompie z końcówką, pozycjonując ją w odległości 20 centymetrów od kolektora.Ustaw pompę na wartość około 0.22 milliliters per hour. Ustaw silnik koła na 300 do 400 rotations per minute. Przyłóż ujemne napięcie polaryzacyjne o wartości 2 kilovolt DC do kolektora oraz dodatnie napięcie 15 kilovolts do płyty przewodzącej, która styka się z metalową końcówką.W przypadku braku dostępu do uziemienia dwubiegunowego zasilacza, włókna z pompy strzykawkowej będą wystrzeliwać z końcówki strzykawki i osadzać się na obracającym się kole. Kontynuuj przędzenie do momentu uzyskania pożądanej gęstości włókien. Aby zapobiec zapchaniu metalowej końcówki, okresowo przecieraj ją ręcznikiem papierowym przymocowanym do nieprzewodzącego pręta. Po przędzeniu nanieś pipetą linię PLGA wokół obwodu szkiełka podstawowego, tworząc w istocie rodzaj fosy wokół elektrod.Pozostaw próbki do wyschnięcia PLGA. Pozwoli to zachować orientację włókien podczas hodowli. Włókna otrzymane metodą elektroprzędzenia oraz kontrolne podłoża szklane muszą zostać pokryte białkiem przed rozpoczęciem hodowli komórkowej.Aby to zrobić, należy pokryć podłoża poliolem, lizyną, lamininą lub fibronektyną przez co najmniej jedną godzinę. Następnie należy odessać nadmiar roztworu, aż podłoża wyschną. W przypadku zastosowania lizyny poliolowej podłoże powinno zostać przepłukane w sterylnej wodzie i dwukrotnie wysuszone po wstępnym pokryciu.Po wyschnięciu umieść podłoża w sześciodołkowych płytkach do hodowli tkankowej, aby przygotować hodowlę komórek, które będą namnażać się na włóknach electros bun. Pobierz zarodki w 15. dniu embrionalnym (E 15) od uśpionej ciężarnej szczurzycy. Rozpocznij od wysterylizowania obszaru 70% etanolem, a następnie rozchyl skórę brzucha.Przetnij warstwy skóry i mięśni, aby odsłonić jamę brzuszną. Zlokalizuj macicę i oddziel ją w obrębie szyjki macicy oraz jajników. Przenieś macicę do sterylnejy szalki.Następnie usuń zarodki z macicy za pomocą nożyczek i natychmiast umieść je w ciepłym medium L 15. Po odcięciu głowy zarodków, ułóż zarodek na boku, chroniąc rdzeń kręgowy jedną parą pincet. Użyj drugiej pary pincet, aby usunąć kończyny i narządy jamy brzusznej.Następnie obróć zarodek i przytrzymaj go nieruchomo jedną pęsetą. Wycinaj wzdłuż osi zarodka od karku do ogona, aż cały rdzeń kręgowy zostanie odsłonięty. Ostrożnie uchwyć koniec rdzenia kręgowego, a następnie pociągnij go na siebie w kierunku ogona.Aby go usunąć, należy pociągnąć za rdzeń, który oddzieli się wraz z przytwierdzoną błoną i zwojami korzeni grzbietowych. Jeśli planowane jest wykonanie preparatu zwojów korzeni grzbietowych x explan lub hodowli dysocjowanych neuronów sensorycznych, należy odciąć zwoje korzeni grzbietowe od rdzenia i przenieść je do nowej szalki z ciepłym podłożem L 15. W przypadku hodowli neuronów ruchowych.Chwyć błonę rdzenia kręgowego na jego przednim końcu i odsuń ją w dół. Analogicznie do zdejmowania długiej skarpetki, powtórz tę czynność dla wszystkich embrionów, a następnie, używając pęsety, posiekaj rdzenie na małe fragmenty, aby uzyskać kultury neuronów ruchowych.Przenieś posiekane rdzenie kręgowe oraz L 15 do probówki stożkowej i wiruj przy 180 ×g przez dwie do trzech minut. Aby odwirować fragmenty, usuń nadsącz i dodaj 3 mL tripsyny do osadu z rdzeniami. Umieść probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i inkubuj przez 20 minut.Po inkubacji do probówki stożkowej należy dodać trzy mililitry FBS. Następnie odwiruj próbkę z prędkością 180 ×g przez dwie do trzech minut w celu odseparowania osadu. W międzyczasie należy przepłukać pipetę Pasteura za pomocą FBS, zasysając płyn do pipety, a następnie go wypuszczając.Zapobiega to przywieraniu fragmentów tkanki do szkła podczas titracji. Po wirowaniu usunięto nadsącz. Następnie do probówki stożkowej dodano jedną pełną pastoraльную pipetę pożywki L 15 i delikatnie utritrowano, używając pipety powlekanej FBS, aż do uzyskania jednorodnego roztworu bez widocznych grudek.Należy unikać pęcherzyków powietrza. Przygotować jedną probówkę z trzema mililitrami 9% opre w L 15 na każde dwa embriony. W przypadku nieparzystej liczby embrionów dodać jedną kroplę.Homogenizat na górze roztworu OptiPrep, dzieląc go równomiernie pomiędzy wszystkie probówki. Homogenizat utworzy widoczną, mętną warstwę na powierzchni roztworu OptiPrep. Wirować probówki z prędkością 700 ×g przez 15 minut.Ostrożnie pobierz górne 2 ml z każdej probówki i przenieś do stożkowatej probówki o pojemności 50 ml. Uzupełnij probówkę pożywką L 15 i wiruj przy 180 ×g przez pięć minut, aby wypłukać komórki z opritu. Usuń nadfazę.Osad jest rzadko widoczny gołym okiem. Na tym etapie, Reese, zresuspenduj komórki w niewielkiej ilości pożywki do wysiewu. Policz komórki, stosując metodę wykluczania błękitu trypanu, aby zidentyfikować żywe komórki.Komórki są teraz gotowe do wysiewu. Aby uzyskać kultury neuronów sensorycznych, oczekiwana jest czystość powyżej 90% neuronów. Rozpocznij od przelania zwojów korzeni grzbietowych usuniętych z rdzeni kręgowych oraz medium L 15 do probówki stożkowej.Wiruj z prędkością 180 ×g przez dwie do trzech minut, aby odwirować fragmenty. Odlej supernatant i dodaj trzy mililitry trypsyny do osadu DRG, a następnie inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Po 10 minutach wyjmij probówkę z kąpieli wodnej, dodaj do niej trzy mililitry FBS i wiruj z prędkością 180 ×g przez dwie do trzech minut, aby ponownie uzyskać osad.W międzyczasie wypłucz pipetę Pasteura polerowaną ogniowo w FBS. Podobnie jak poprzednio, użyj pipety powlekanej FBS, aby dodać do osadu pełną objętość pipety medium L 15 i delikatnie tryturuj do uzyskania jednorodnego roztworu bez widocznych grudek. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza, a następnie odwiruj homogenizat przy 180 ×g przez pięć minut.Usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w niewielkiej ilości pożywki do wysiewu neuronów sensorycznych. Policz komórki, stosując metodę wykluczania błękitu trypanu w celu zidentyfikowania żywych komórek. Komórki są teraz gotowe do wysiewu w celu hodowli neuronów sensorycznych lub ruchowych.Zacznij od pokrycia podłoży z włókien elektroprzędzonych powlekanych białkiem kilkoma kroplami pożywki. Następnie dodaj odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej. Rozdzielone komórki należy wysiać przy niskiej gęstości.Pozostawić komórki w inkubatorze na co najmniej jedną godzinę w celu ich przylgnięcia, a następnie wypełnić dołki pożywką i ponownie umieścić je w inkubatorze do hodowli. Przykryć podłoża z elektroprzędzonych włókien powlekanych białkiem kilkoma kroplami pożywki. Następnie dodać zwoje korzeni grzbietowych do pożywki.Ułóż zwoje korzeni grzbietowych tak, aby były równomiernie rozmieszczone na podłożu. Na szkiełku podstawnym o wymiarach 22 by 22 milimetrów zmieści się około czterech zwojów korzeni grzbietowych. Umieść hodowle zwojów korzeni grzbietowych w inkubatorze w temperaturze 37 °C i pozostaw je do przywarcia na co najmniej cztery godziny po inkubacji.Zalej studzienki pożywką i przenieś je z powrotem do inkubatora. Hodowle można utrzymywać do czterech dni bez wymiany pożywki. W przypadku dłuższych hodowli należy przeprowadzać połowiczą wymianę pożywki na pożywkę do dokarmiania.Pożywka do dokarmiania ma taki sam skład jak pożywka do wysiewu, z wyjątkiem L-glutaminy. Po osiągnięciu przez komórki pożądanego punktu czasowego można przeprowadzić immunocytochemię zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym protokole pisemnym. Ten obraz SEM ilustruje typową morfologię uporządkowanych i przypadkowych włókien wytworzonych metodą elektroprzędzenia.Orientacja włókien jest regulowana poprzez wybór kolektora. Należy zauważyć, że włókna przędzone na rotacyjnym kole kolektora są jednorodnie uporządkowane. W przeciwieństwie do nich, włókna przędzone na kolektorze stacjonarnym wykazują przypadkową morfologię.Obrazy te przedstawiają barwienie neuronów ruchowych na beta tubulinę (kolor zielony) oraz barwienie jąder DPI (kolor niebieski). Po 24 godzinach hodowli na włóknach powlekanych PLL oraz na szkle z włóknami, neurony ruchowe zazwyczaj posiadają kilka wypustek wychodzących z ciała komórki równolegle do kierunku ułożenia włókien, który na tym obrazie przebiega od lewej do prawej strony. Główne wypustki komórek hodowanych na włóknach są znacznie dłuższe niż główne wypustki komórek hodowanych na szkle w tym samym czasie.Neurony ruchowe hodowane na szkle zazwyczaj posiadają po 24 godzinach więcej wypustek, które rozrastają się promieniście od ciała komórki. Neurony hodowane na włóknach. Główny wypust jest również krótszy na szkle niż te widoczne na włóknach na tych obrazach.Zwoje korzeni grzbietowych zostały zabarwione na neurofilamenty, przedstawione kolorem zielonym. Po trzech dniach hodowli na szkle powlekanym PLL oraz włóknach na szkle, neuryty wyrastają promieniście ze zwoju korzeni grzbietowych. Obserwuje się również znaczące nakładanie się sąsiednich neurytów na włóknach.Neuryty również wyrastają promieniście z zwoju. Następnie jednak skręcają i biegną zgodnie z kierunkiem ułożonych włókien. Po opanowaniu tych procedur nakładanie się sąsiednich neurytów jest znacznie mniejsze.Elektroprzędzenie można przeprowadzić w ciągu około 30 minut, a neurony ruchowe i sensoryczne można uzyskać w ciągu około dwóch godzin. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o stosowaniu technik sterylnych. W celu zmaksymalizowania przeżywalności neuronów podczas etapu iteracji niezbędne jest użycie pipety wypalanej ogniowo.Dodatkowo ważne jest inkubowanie cząsteczek adhezyjnych oraz włókien otrzymanych metodą elektroprzędzenia przez odpowiedni czas. Na przykład, jeśli włókna będą powlekane polilizyną przez mniej niż jedną godzinę, warstwa powłoki będzie niewystarczająca, aby zapewnić adhezję komórek. Jednakże, jeśli polilizyna pozostanie na włóknach zbyt długo, na przykład przez noc, włókna mogą ulec degradacji.Należy również pamiętać, że większość mikroskopów nie umożliwia wizualizacji neuronów na włóknach podczas hodowli. Wynika to z faktu, że włókna i wypustki neuronalne wyglądają niemal identycznie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak hodować pierwotne kultury neuronów ruchowych i czuciowych z szczurów w 15. dniu embrionalnym na podłożach z włókien elektroprzędzionych.Należy pamiętać, że praca z wysokimi napięciami może być niezwykle niebezpieczna i należy zawsze stosować odpowiednie środki ostrożności, aby odizolować operatora od urządzenia do elektroprzędzenia.

the-culture-primary-motor-sensory-neurons-defined-media-on

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Kultura Pierwotnych Neuronów Motorycznych i Czułych w Zdefiniowanych Mediach na Elektrowrzecionach Nanowłókna Poli-L-laktydowego

Rusztowania otrzymane metodą elektroprzędzenia mogą być poddawane obróbce po produkcji w celu zastosowania ich w inżynierii tkankowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody przędzenia złożonych rusztowań (poprzez przędzenie sekwencyjne), tworzenia rusztowań o większej grubości (poprzez nakładanie wielu warstw z wykorzystaniem wyżarzania termicznego lub parowego), zapewniania sterylności (produkcja aseptyczna lub sterylizacja po produkcji) oraz uzyskiwania odpowiednich właściwości...

Obróbka potransprodukcyjna włókien otrzymywanych metodą elektroprzędzenia do inżynierii tkankowej

Ten film prezentuje tworzenie 3D spolaryzowanego modelu tkanki nerwowej z wykorzystaniem rusztowań jedwabno-kolagenowych. Szczegółowo opisuje proces wysiewania komórek neuronalnych na porowatych rusztowaniach z jedwabiu, inkubacji w celu przyczepienia komórek, osadzania rusztowania kolagenem i podkreśla znaczenie wspierającej macierzy kolagenowej w tworzeniu spolaryzowanego modelu tkanki nerwowej 3D.

Opracowanie zmodyfikowanego modelu 3D spolaryzowanej tkanki nerwowej na bazie jedwabiu

Ten protokół łączy elektroprzędzenie i mikrosfery w celu opracowania rusztowań inżynierii tkankowej do kierowania neuronami. Czynnik wzrostu nerwów zamknięto w mikrosferach PLGA i elektroprzędzono w rusztowania włókniste z kwasem hialuronowym (HA).  Bioaktywność białka badano poprzez wysiewanie rusztowań pierwotnymi zwojami korzenia grzbietowego piskląt i hodowlę przez 4-6 dni.

Elektroprzędzenie Czynnik wzrostu uwalniający mikrosfery do włóknistych rusztowań

Zgłoszono syntezę i wytwarzanie długich włókien elektroprzędzionych obejmujących większy obszar złoża za pomocą nowo zaprojektowanego kolektora z nowego biodegradowalnego polimeru o nazwie poli(dodekanian glicerolu) (PGD). Włókna były w stanie wspierać wzrost komórek pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych myszy.

Elektroprzędzone rusztowania włókniste z poli(dodekanodianu glicerolu) do inżynierii tkanek nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Ten artykuł opisuje szereg ustawień do wysiewu ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych na materiały, w tym przypadku przędze elektroprzędzone, które nie pokrywają podstawy standardowych płytek dołków hodowlanych, aby zmaksymalizować i określić ilościowo liczbę komórek, które początkowo się przyczepiają, w porównaniu do znanej gęstości wysiewu.

Optymalizacja mocowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do przędz elektroprzędzonych z poli(ε-kaprolaktonu)

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania elektroprzędzonych rusztowań z nanowłókien o stopniowanej organizacji włókien i badamy ich zastosowania w regulacji morfologii/orientacji komórek. Gradienty w odniesieniu do właściwości fizycznych i chemicznych rusztowań z nanowłókien oferują szeroką gamę zastosowań w dziedzinie biomedycyny.

Rusztowania z nanowłókien elektroprzędzonych z gradacją w organizacji włókien

Wgląd w złożone działania mózgu wymaga zaawansowanych narzędzi badawczych. Tutaj demonstrujemy nowatorski, oparty na jedwabnym kolagenie, zaprojektowany w 3D model tkanki nerwowej przypominający architekturę przypominającą mózg. Model może być wykorzystany do badania budowy sieci neuronalnej, prowadzenia aksonów, interakcji komórka-komórka i aktywności elektrycznej.

Zaprojektowany model 3D spolaryzowanej tkanki nerwowej oparty na jedwabiu

Postępy w technologiach biomateriałów umożliwiają rozwój trójwymiarowych konstruktów wielokomórkowych. Opracowaliśmy protokoły elektroprzędzenia w celu wytworzenia trzech pojedynczych rusztowań do hodowli głównych komórek strukturalnych dróg oddechowych, aby zapewnić model 3D in vitro ściany oskrzelików dróg oddechowych.

Dostosowanie procesu elektroprzędzenia w celu zapewnienia trzech unikalnych środowisk dla trójwarstwowego modelu ściany dróg oddechowych in vitro

Tutaj prezentujemy protokół hodowli 3D komórek glejowych pochodzących z mózgu szczura, w tym astrocytów, mikrogleju i oligodendrocytów. Pokazujemy pierwotną hodowlę komórkową, syntezę hydrożelu metakrylowanego kwasu hialuronowego (HAMA), fotopolimeryzację HAMAfotopolimeryzację i enkapsulację komórek oraz przetwarzanie próbek do konfokalnego i skaningowego obrazowania mikroskopem elektronowym.

Ulepszone hodowle hydrożelowe 3D pierwotnych komórek glejowych do modelowania in vitro zapalenia układu nerwowego

Ta metodologia ma na celu zilustrowanie mechanizmów, za pomocą których sygnały macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak sztywność substratu, skład białka i morfologia komórki, regulują fenotyp komórek Schwanna (SC).

Przygotowanie przestrajalnych mikrośrodowisk macierzy zewnątrzkomórkowej w celu oceny specyfikacji fenotypu komórek Schwanna

Tutaj pokazujemy, jak komórki nabłonkowe hodowane z fibroblastami w dwuwarstwowym systemie opartym na błonie nanowłóknistej mogą stabilnie przylegać do błony i rosnąć na niej.

Stworzenie trójwymiarowego modułu kokultury komórek nabłonkowych z wykorzystaniem błon nanowłóknistych

Poznaj metodę hodowli pierwotnych neuronów szczura na wyrównanych rusztowaniach z nanowłókien poli-L-laktydowych. Technika ta umożliwia badanie kierunkowanego wzrostu neuritów w kontekście neuroregeneracji.

Hodowla pierwotnych neuronów ruchowych i czuciowych w określonych pożywkach na elektroprzędzonych rusztowaniach z nanowłókien poli-L-laktydowych (Wideo) | JoVE Journal

Hodowla pierwotnych neuronów ruchowych i sensorycznych w zdefiniowanych mediach na rusztowaniach z nanowłókien z poli-L-laktydu otrzymanych metodą elektroprzędzenia

Przeglądaj więcej filmów