JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:50 min. • August 29th, 2025
Rozmrozić neuronalne komórki progenitorowe lub NPC przechowywane z krioprotektantem w bloku cieplnym.
Te NPC wyrażają zwiększoną alfa-synukleinę, kluczowy czynnik w chorobie Parkinsona.
Przenieś rozmrożone komórki do probówki zawierającej ciepłe podłoże podstawowe w celu rozcieńczenia krioprotektantu.
Odwirować w celu osadzenia komórek, usunięcia supernatantu i ponownego zawieszenia osadu w pożywce neuronowej.
Dodać zawiesinę komórkową na płytkę wielodołkową pokrytą ECM i inkubować, aby umożliwić adhezję i proliferację komórek.
Dodaj wektory lentiwirusowe zawierające przewodnikowe RNA, dezaktywowaną metylotransferazę Cas9-DNA i gen oporności na antybiotyki.
Inkubacja w celu ułatwienia wnikania wirusa, odwrotnej transkrypcji wirusowego RNA, integracji z genomem gospodarza i ekspresji transgenu.
Przewodnik RNA kieruje dCas9 do genu alfa-synukleiny, gdzie metylacja DNA za pośrednictwem metylotransferazy zmniejsza ekspresję alfa-synukleiny.
Zastąp pożywkę pożywką neuronalną zawierającą antybiotyki, aby wybrać transdukowane komórki, podczas gdy komórki nietransdukowane ulegają apoptozie.
Umieść Cryovial z MD NPC w bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie minuty i przenieś rozmrożone komórki do 15-mililitrowej stożkowej rurki z 10 mililitrami ciepłego DMEM-F12.
Wirować przy 300 g przez pięć minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki N2B2. Dodać dwa mililitry N2B27 do zawiesiny komórek i umieścić dwa mililitry komórek w każdym dołku wcześniej przygotowanej płytki sześciodołkowej pokrytej BMM.
Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO_2 przez noc. Gdy NPC MD osiągną 70% konfluencji, transdukuj je, dodając dwa mikrolitry wektorów przewodnika RNA d-Cas9-DNMT3A lentiwirusa i delikatnie zakręć płytką. Po inkubacji komórek w tych samych warunkach, co poprzednio, przez 16 godzin, zastąp pożywkę N2B27 48 godzin po transdukcji.
Dodać N2B27 z pięcioma mikrogramami na mililitr puromycyny