Transdukcja lentiwirusowa nerwowych komórek progenitorowych w celu epigenetycznej regulacji ekspresji alfa-synukleiny

Rozmrozić neuronalne komórki progenitorowe lub NPC przechowywane z krioprotektantem w bloku cieplnym.

Te NPC wyrażają zwiększoną alfa-synukleinę, kluczowy czynnik w chorobie Parkinsona.

Przenieś rozmrożone komórki do probówki zawierającej ciepłe podłoże podstawowe w celu rozcieńczenia krioprotektantu.

Odwirować w celu osadzenia komórek, usunięcia supernatantu i ponownego zawieszenia osadu w pożywce neuronowej.

Dodać zawiesinę komórkową na płytkę wielodołkową pokrytą ECM i inkubować, aby umożliwić adhezję i proliferację komórek.

Dodaj wektory lentiwirusowe zawierające przewodnikowe RNA, dezaktywowaną metylotransferazę Cas9-DNA i gen oporności na antybiotyki.

Inkubacja w celu ułatwienia wnikania wirusa, odwrotnej transkrypcji wirusowego RNA, integracji z genomem gospodarza i ekspresji transgenu.

Przewodnik RNA kieruje dCas9 do genu alfa-synukleiny, gdzie metylacja DNA za pośrednictwem metylotransferazy zmniejsza ekspresję alfa-synukleiny.

Zastąp pożywkę pożywką neuronalną zawierającą antybiotyki, aby wybrać transdukowane komórki, podczas gdy komórki nietransdukowane ulegają apoptozie.

Umieść Cryovial z MD NPC w bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie minuty i przenieś rozmr