Wstrzykiwanie fluorescencyjnych nerwowych komórek progenitorowych do ludzkich organoidów mózgowych w celu modelowania transplantacji
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:40 min • August 29th, 2025
Zacznij od znakowanych fluorescencyjnie indukowanych pluripotencjalnych komórek progenitorowych pochodzących z nerwowych komórek progenitorowych lub NPC.
Ponownie zawiesić komórki w hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej, aby utworzyć jednolitą mieszaninę komórka-macierz
.Inkubować mieszaninę na lodzie.
Następnie przenieś ludzki organoid mózgowy do naczynia.
Usuń nadmiar pożywki i umieść naczynie pod mikroskopem w celu wykonania procedury wstrzykiwania.
Dozować mieszaninę komórkowo-matrycową na wstępnie schłodzone, sterylne szkiełko podstawowe i odessać za pomocą wstępnie schłodzonej strzykawki.
Powoli wstrzyknij mieszaninę na powierzchnię organoidu, aby zminimalizować rozerwanie tkanki.
Pozwól organoidowi krótko odpocząć, a następnie dodaj pożywkę, przenieś organoid na płytkę wielodołkową i inkubuj.
Hydrożel zestala się, zakotwiczając NPC w miejscu wstrzyknięcia. Śledź NPC za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Z biegiem czasu NPC namnażają się i migrują do odległych regionów organoidu, gdzie różnicują się w niedojrzałe i dojrzałe neurony.
Umożliwia to niezawodny przeszczep komórek przy minimalnym zakłóceniu organoidów, odpowiedni do terapii komórkami nerwowymi.
Zacznij od usunięcia z lodu zawiesiny pojedynczej komórki indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub nerwowych komórek progenitorowych pochodzących z iPSC lub NPC i odwirowania ich w sile 300 g przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 3 miligramach na mililitr rozpuszczonej matrycy błony podstawnej, aby uzyskać końcową objętość dwóch mikrolitrów na wstrzyknięcie. Zawiesinę należy natychmiast odłożyć z powrotem na lód do czasu użycia. Przenieś wstępnie schłodzoną strzykawkę z zamrażarki o temperaturze 20 stopni Celsjusza do wiadra z lodem w celu dalszego użycia.
Następnie wyjmij płytkę organoidu mózgowego z inkubatora i przenieś organoid do 35-milimetrowej płytki za pomocą końcówki o szerokim otworze. Aby ustabilizować organoidy i ułatwić wstrzyknięcie, należy usunąć pożywkę w jak największym stopniu, nie uszkadzając organoidu. Umieścić 35-milimetrową szalkę zawierającą organoid pod mikroskopem preparacyjnym, aby ułatwić wstrzyknięcie.
Gdy organoidy będą gotowe do wstrzyknięcia, delikatnie ponownie zawieś komórki NPC oznaczone EGFP za pomocą schłodzonej końcówki pipety P20 i przenieś dwa mikrolitry tych komórek na wstępnie schłodzone sterylne szkiełko podstawowe. Weź z lodu ampułkostrzykawkę insulinową i powoli nabierz 2 mikrolitry zawiesiny komórkowej skosem igły skierowanym w dół. Otwórz pokrywę naczynia zawierającego organoid przed ustawieniem na nim ostrości mikroskopu.
Przytrzymaj naczynie jedną ręką, umieść skos igły do góry. A drugą ręką powoli wstrzyknij komórkę w powierzchnię organoidu. Po wstrzyknięciu komórek umieść pokrywkę z powrotem w naczyniu i inkubuj wstrzyknięty organoid przez jedną do dwóch minut.
Następnie delikatnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki organoidowej do płytki przed przeniesieniem organoidu do 24-dołkowej płytki z końcówką o szerokim otworze. Inkubuj organoid w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5 procent dwutlenku węgla z pełną wymianą pożywki co drugi dzień.
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje metodę wstrzykiwania fluorescencyjnie znakowanych komórek progenitorowych neuronów (NPCs) pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do ludzkich organoidów mózgu. Technika ta minimalizuje uszkodzenia tkanki i umożliwia skuteczną transplantację komórek, co jest kluczowe dla terapii komórkami neuronowymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórek macierzystych
- Terapia komórkowa
Wstęp
- Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSCs) mogą różnicować się w różne typy komórek.
- Neuralne komórki progenitorowe (NPCs) są niezbędne dla rozwoju i regeneracji mózgu.
- Ludzkie organoidy mózgu służą jako modele do badania rozwoju mózgu.
- Skuteczne techniki transplantacji komórek są niezbędne w zastosowaniach terapeutycznych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody wstrzykiwania NPC do organoidów mózgowych.
- Śledzenie zachowania NPC po wstrzyknięciu przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
- Ocena żywotności i integracji NPC w obrębie organoidu.
Zastosowane metody
- Przygotowanie NPC z iPSC i resuspensja w hydrożelu.
- Wstrzyknięcie mieszaniny komórki i macierzy do organoidu za pomocą schłodzonej wcześniej strzykawki.
- Monitorowanie proliferacji i migracji NPC w obrębie organoidu.
- Inkubacja organoidu w kontrolowanych warunkach po wstrzyknięciu.
Główne wyniki
- NPC zostały pomyślnie zintegrowane z organoidem przy minimalnym zaburzeniu jego struktury.
- Mikroskopia fluorescencyjna potwierdziła proliferację i migrację NPC.
- Wstrzyknięte NPC zróżnicowały się w czasie w neurony niedojrzałe i dojrzałe.
- Metoda ta wykazała potencjał w zastosowaniach w ramach terapii komórkami neuronowymi.
Wnioski
- Opracowana technika iniekcji jest skuteczna w transplantacji NPC.
- Metoda ta może wspomóc badania nad rozwojem i regeneracją mózgu.
- Przyszłe badania mogą zgłębiać zastosowania terapeutyczne w chorobach neurodegeneracyjnych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modelowanie transplantacji komórek progenitorowych neuronów w ludzkich organoidach mózgu zapewnia powtarzalną, wolną od zwierząt platformę do oceny integracji i różnicowania komórek w kontekście chorób OUN. Podejście to umożliwia predykcyjną ocenę strategii terapii komórkami neuronowymi na etapie przedklinicznym, wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz ciągłość translacyjną w ramach portfeli neuroregeneracyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie zachowania komórek progenitorowych neuronów w ludzkim, trójwymiarowym modelu mózgu.
- Wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez śledzenie proliferacji, migracji i różnicowania komórek po transplantacji.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla kandydatów do terapii komórkowej OUN.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zstandaryzowany, powtarzalny schemat pracy dla iniekcji i śledzenia komórek neuronalnych w organoidach.
- Zapewnia ilościowe wyniki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej do analizy losu i integracji komórek.
- Przygotowuje zwalidowane systemy organoidów do dalszego screeningu związków chemicznych lub genetycznego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelowaniem chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN) z wykorzystaniem organoidów pochodzenia ludzkiego.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od etapu odkrywania do przedklinicznej walidacji metod terapii komórkowej.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka poprzez modelowanie integracji neuronów ludzkich ex vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z continuum od odkrywania do badań przedklinicznych w terapii komórkowej OUN, stanowiąc pomost między wczesnymi badaniami mechanistycznymi a modelowaniem translacyjnym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących zaprawiania i różnicowania komórek neuronalnych w kontekście ludzkim.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty dotyczące przeznaczenia i migracji komórek.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie wyników transplantacji w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Stanowi platformę do oceny zachowania komórek terapeutycznych w organoidach istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalny system wolny od zwierząt, który można dostosować do różnorodnych programów terapii komórkowej OUN.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie mechanizmów i integracji terapii komórkami neuronalnymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje modelowanie transplantacji przy minimalnym uszkodzeniu tkanek i wysokiej powtarzalności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dla kandydatów do terapii komórkowej OUN poprzez wczesne dostarczanie danych istotnych dla ludzi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację zasobów terapii komórkowej skierowanych przeciwko zaburzeniom OUN z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek macierzystych, pracy z organoidami oraz technik mikroińekcji.
- Wymaga dostępu do mikroskopii fluorescencyjnej i infrastruktury kontrolowanej inkubacji.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności protokołów przygotowania komórek i iniekcji.
- Można dostosować do różnych źródeł komórek progenitorowych neuronów i modeli organoidów.
- Ograniczone do modelowania ex vivo; translacja in vivo wymaga dalszej walidacji.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Wytwarzanie organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w domowych mini bioreaktorach
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Wysokoprzepustowa platforma do hodowli i obrazowania 3D organoidów
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Przeszczepianie progenitorów neuronalnych pochodzących z komórek macierzystych do ludzkich wycinków korowych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Przeszczep ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Metoda in vitro do generowania organoidów ludzkiego mózgu
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Solidna i wysoce odtwarzalna generacja organoidów korowych mózgu do modelowania starzenia się neuronów mózgu in vitro
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ludzki model organoidowy przeszczepu komórek nerwowych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026