Decelularyzacja i recelularyzacja całych wątrób

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie zdekularyzowanych przeszczepów wątroby z wykorzystaniem macierzy wątrobowej pozbawionej komórek. Osiąga się to poprzez uprzednią kaniulację wątroby donora. Następnie narząd jest dekomórkowany poprzez perfuzję szeregiem roztworów detergentów.

Następnie przeprowadzana jest rewascularyzacja odkomórkowanej macierzy wątrobowej poprzez perfuzyjne wprowadzenie pierwotnych hepatocytów dorosłych. Na koniec, w celu hodowli i recelularyzacji przeszczepu wątroby, stosowany jest system perfuzji in vitro. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące funkcje wątrobowe przeskalowanych przeszczepów in vitro poprzez pomiar wydzielania albumin, mocznika oraz całkowitych kwasów żółciowych do medium perfuzyjnego.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wytwarzanie rusztowań z syntetycznych biomateriałów oraz tradycyjne techniki inżynierii tkankowej, jest w mojej opinii obecność składników macierzy zewnątrzkomórkowej specyficznej dla danej tkanki. Perfuzyjnie zdecelularyzowany rusztowanie posiada również specyficzną dla tkanki mikroarchitekturę, taką jak struktura naczyniowa. Obecność struktury naczyniowej umożliwia nam bardziej jednorodne ponowne wprowadzenie komórek do rusztowania.

Umożliwia to również jednorodne perfundowanie go składnikami odżywczymi w celu zwiększenia przeżywalności komórek. Część protokołu dotyczącą zwalniania zostanie zaprezentowana przez Nimę wraz z postdoktorem z naszego laboratorium. Część dotyczącą re-retailizacji zaprezentuje Gabriel Price, który również jest postdoktorem.

Jej praca koncentruje się na uprzemysłowieniu tych przeszczepów. Aby przeprowadzić decelularyzację perfuzyjną, należy rozpocząć od pobrania wątroby szczura poprzez kaniulację żyły wrotnej. Używając cewnika 18G, pozostaw otwarte żyłę główną dolną i górną. Organ należy utrzymać w nawilżeniu w roztworze soli fosforanowej (PBS) w 10-centymetrowej szalce Petriego.

Następnie należy przygotować system perfuzyjny składający się z ośmiolitrowego zbiornika, pompy perystaltycznej oraz pułapki pęcherzykowej. System perfuzyjny należy wypełnić solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) i pozostawić w działaniu przez 10 minut. Następnie należy wypełnić 10 centymetrową szalkę Petriego PBS i zmniejszyć szybkość przepływu buforu do 1,2 milliliters per minute.

Ostrożnie przenieś pobraną wątrobę do szalki Petriego z PBS i pozostaw do perfuzji przez noc. Następnego dnia przeprowadź perfuzję wątroby 0,01% roztworem dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie destylowanej przez pięć minut.

Następnie powróć do perfuzji PBS przez jedną godzinę. Powtórz etapy perfuzji SDS i PBS jeszcze trzy razy, zwiększając czas perfuzji SDS do 10, 15, a na koniec do 20 minut. Następnie przeprowadź perfuzję wątroby z następującej serii: 0.01% SDS przez 24 godziny.

0,1% SDS przez 24 godziny. 0,2% SDS przez trzy godziny, 0,5% SDS przez trzy godziny. Woda destylowana przez 15 minut, 1% Triton X 100 w wodzie destylowanej przez 30 minut, co usunie wszelkie związane kwasy nukleinowe.

I na koniec, przez dwie godziny stosuje się PBS, który w razie potrzeby wypłucze odkomórkowaną macierz wątrobową (DLM) po zakończeniu perfuzji; następnie należy wyciąć wszystkie płaty z wyjątkiem płata środkowego. DLM należy przechowywać w czystej i szczelnie zamkniętej szalce Petriego w PBS w temperaturze 4°C do momentu rozpoczęcia sterylizacji. W celu sterylizacji DLM należy przepłukać ją sterylnym PBS zawierającym 0,1% kwasu nadoctowego i 4% etanolu, a następnie inkubować przez trzy godziny w temperaturze 4°C.

Następnie dwa razy przemyj DLM sterylnym PBS. Potem przemyj go PBS zawierającym 2% penicyliny streptomycyny (10 µg/mL) oraz gentamycyny i amfoterycyny B (2,5 µg/mL). Przechowuj odkomórkowaną wątrobę w tym samym roztworze w temperaturze 4 °C do czasu rozpoczęcia eksperymentów z recelularyzacją.

Po drugie, należy przeprowadzić recelularyzację zdecelularyzowanej macierzy wątrobowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Należy rozpocząć od przygotowania systemu perfuzyjnego podobnego do tego, który był używany do decelularyzacji wątroby. System perfuzyjny należy wypełnić 200 ml pożywki hodowlanej, takiej jak DMEM z wysoką zawartością glukozy, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 j./ml penicyliny oraz 100 µg/ml streptomycyny.

Umieść DLM w komorze perfuzyjnej i podłącz go do systemu perfuzyjnego za pomocą kaniuli żyły wrotnej, podczas gdy pompa pracuje z prędkością 5 ml/min. Aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza, pozwól, aby medium perfundowało DLM przez 30 minut. Następnie zatrzymaj przepływ w systemie perfuzyjnym i powoli wstrzyknij do systemu perfuzyjnego przez pułapkę pęcherzykową 50 milionów hepatocytów wyizolowanych z dorosłego szczura.

Wznowić przepływ z prędkością 10 ml/min i rekrykulować medium przez 10 minut. Ponownie zatrzymać przepływ medium. Wstrzyknąć dodatkowe 50 milionów hepatocytów.

Następnie ponownie uruchom przepływ z prędkością 10 ml/min. Powtarzaj tę procedurę, aż do momentu wprowadzenia do DLM łącznie 200 milionów hepatocytów. Po wstrzyknięciu wszystkich komórek do DLM, zbierz przelew do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i wiruj przy 800 obr./min przez pięć minut.

Odlej nadsączniki i połącz osady w jednej probówce. Oznacz liczbę komórek oraz ich żywotność metodą wykluczania błękitu trypanu. Pozwoli to ustalić wydajność wysiewu do hodowli.

Komórkowanie przeszczepu wątroby. Przygotuj sterylną układ perfuzyjny zawierający oksygenator. Napełnij układ perfuzyjny 50 milliliters pożywki hodowlanej, takiej jak Williams E z 5%PBS, oraz 0,5 units per milliliter insuliny.

20 ng/mL EGF, 14 ng/mL glukagonu, 7,5 µg/mL hydrokortyzonu, 100 j/mL penicyliny oraz 100 µg/mL streptomycyny. Umieść zdepcelularyzowany przeszczep wątroby w komorze perfuzyjnej i podłącz go do układu perfuzyjnego poprzez kaniulę żyły wrotnej, gdy pompa pracuje z przepływem 5 mL/min.

Aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, aseptycznie zamknij komorę perfuzyjną i szczelnie ją uszczelnij, aby zapobiec wyciekom podczas hodowli. Inkubuj system perfuzyjny w temperaturze 37 °C przy 10% CO2 i zwiększ szybkość przepływu perfuzji do 15 mL/min. Podłącz natleniacz do zbiornika z mieszaniną gazów zawierającą 95% O2 i 5% CO2, a następnie ustaw przepływ gazu na 0,5 L/min.

Powinno to zapewnić ciśnienie parcjalne tlenu na poziomie około 400 mmHg. Kontynuuj hodowlę do 10 dni, codziennie wymieniając pożywkę. Codziennie pobieraj próbki pożywki w celu oznaczenia wydzielania albumin, mocznika i całkowitych kwasów żółciowych, aby monitorować funkcje wątroby przeszczepu pod koniec okresu hodowli.

Pobierz próbki z decelularyzowanego przeszczepu wątroby do analizy molekularnej i histologicznej. Pełna decelularyzacja wątroby szczura trwa około 72 godzin przy zastosowaniu opisanego protokołu.

Otrzymana macierz zachowuje 100% kolagenu włóknistego, 50% glikozaminoglikanów i jedynie 5% DNA natywnej wątroby. Struktura naczyniowa macierzy zostaje zachowana, co potwierdzono w analizie z wykorzystaniem odlewania korozyjnego oraz skaningowej mikroskopii elektronowej. Obecność mikroarchitektury naczyniowej w DLM ułatwia ponowne zasiedlenie go komórkami z wydajnością 96% oraz jego późniejszą perfuzję.

W przypadku hodowli in vitro, przeszczep wątroby może być hodowany do 10 dni in vitro i wykazuje prawidłowe funkcje wątroby, co potwierdzono poprzez pomiar wydzielania albumin, mocznika i całkowitych kwasów żółciowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić decelularyzację i recelularyzację całej wątroby.