Name: Decelularyzacja i recelularyzacja całych wątrób (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-04T17:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj metodę decelularyzacji i recelularyzacji całych wątrób w celu inżynierii narządów. Technika ta umożliwia przygotowanie szkieletów macierzy zewnątrzkomórkowej i ich zaludnienie hepatocytami w celu uzyskania funkcjonalnych przeszczepów wątroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Jackowi Milwidowi za zaprojektowanie komory perfuzyjnej in vitro. Praca ta była wspierana przez granty z amerykańskiego NIH, R01DK59766 oraz R01DK084053 dla M.Y., R00DK080942 dla K.U., amerykańskiego NSF CBET- 0853569 dla K.U. oraz Shriners Hospitals for Children dla B.E.U. (grant nr 8503). Dziękujemy również za wsparcie udzielone przez Shriners Hospitals for Children.

1. Dekomórkowanie wątroby
<ol>
	<li>Pobrać wątrobę szczura, kaniulując żyłę wrotną za pomocą cewnika 18G. Pozostawić otwarte żyłę główną dolną i górną. Przechowywać organ w stanie nawodnionym w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w szalce Petriego o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Przygotować układ perfuzyjny składający się z 8-litrowego zbiornika, pompy perystaltycznej oraz pułapki pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Napełnić układ perfuzyjny roztworem PBS i utrzymywać przepływ przez 10 minut. Nalać PBS do szalki Petriego o średnicy 10 cm i zmniejszyć szybkość przepływu roztworu PBS do 1 mL/min.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść pobraną wątrobę do szalki Petriego o średnicy 10 cm wypełnionej roztworem PBS.</li>
	<li>Kontynuować perfuzję PBS przez noc.</li>
	<li>Rozpocząć perfuzję 0,01% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie destylowanej przez 5 minut.</li>
	<li>Perfundować PBS przez 1 godzinę.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 1.6 i 1.7 jeszcze trzy razy, zwiększając czas perfuzji SDS do odpowiednio 10, 15 i 20 minut przy każdej kolejnej serii.</li>
	<li>Kontynuować perfuzję 0,01% (w/v) SDS przez 24 godziny.</li>
	<li>Kontynuować perfuzję 0,1% (w/v) SDS przez 24 godziny.</li>
	<li>Perfundować 0,2% (w/v) SDS przez 3 godziny.</li>
	<li>Perfundować 0,5% (w/v) SDS przez 3 godziny.</li>
	<li>Perfundować wodą destylowaną przez 15 minut.</li>
	<li>Perfundować 1% (w/v) Triton X-100 w wodzie destylowanej przez 30 minut w celu usunięcia związanych kwasów nukleinowych.</li>
	<li>Aby wypłukać zdecelularyzowaną macierz wątroby (DLM), perfundować PBS przez 2 godziny.</li>
	<li>Opcjonalnie: wyciąć wszystkie płaty z wyjątkiem płata środkowego.</li>
	<li>Przechowywać DLM w czystej i szczelnie zamkniętej szalce Petriego zanurzonej w PBS w temperaturze 4oC do momentu użycia (Rysunek 1).</li>
	<li>Aby wysterylizować DLM: 1) Przepłukać DLM sterylnym PBS zawierającym 0,1% (v/v) kwasu nadoctowego i 4% (v/v) etanolu, a następnie inkubować przez 3 godziny w temperaturze 4oC. 2) Wypłukać sterylnym PBS 2 razy. 3) Wypłukać sterylnym PBS zawierającym 2% penicyliny-streptomycyny, 10ug/ mL gentamycyny oraz 2,5 ug/ mL amfoterycyny B. Przechowywać zdecelularyzowaną wątrobę w tym samym roztworze w temperaturze 4oC do czasu rozpoczęcia eksperymentów z recelularyzacją.</li>
</ol>
2. Rekomórkowienie odkomórkowanej macierzy wątroby
<ol>
	<li>W warunkach sterylnych przygotować układ perfuzyjny składający się z komory perfuzyjnej, pompy perystaltycznej oraz pułapki na pęcherzyki powietrza. Napełnić układ perfuzyjny 200 mL pożywki hodowlanej, np. DMEM z wysoką zawartością glukozy (Sigma), 10% płodowej surowicy bydlęcej (Hyclone,), 100 U mL-1 penicyliny oraz 100 μg mL-1 streptomycyny (Invitrogen).</li>
	<li>Umieścić zdecelularyzowaną macierz wątroby w komorze perfuzyjnej i połączyć DLM z układem perfuzyjnym poprzez kaniulę żyły wrotnej, podczas gdy pompa pracuje z prędkością 5 mL/min, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Przeprowadzić perfuzję pożywki przez DLM przez 30 minut.</li>
	<li>Wyizolować pierwotne hepatocyty od dorosłego szczura o żywotności co najmniej 90%.</li>
	<li>Zatrzymać przepływ w układzie perfuzyjnym i powoli wstrzyknąć 50 milionów hepatocytów (w 1-3 mL pożywki hodowlanej) do układu perfuzyjnego przez pułapkę na pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Uruchomić przepływ z prędkością 10 mL/min i recyrkulować pożywkę przez 10 minut.</li>
	<li>Powtarzać kroki 2.5 i 2.6 do momentu wprowadzenia do DLM łącznie 200 milionów komórek (Rysunek 2)6.</li>
	<li>Po upłynnięciu wszystkich komórek do DLM, zebrać perfuzat do czterech 50-ml probówek wirówkowych i wirować z prędkością 600 rpm przez 10 minut. Odrzucić nadsącz i zebrać osady do jednej probówki. Określić liczbę komórek i ich żywotność za pomocą metody wykluczania błękitu trypanu, aby wyznaczyć wydajność zasiewu.</li>
</ol>
3. Kultura in vitro recelularyzowanego przeszczepu wątroby
<ol>
	<li>W warunkach sterylnych przygotować układ perfuzyjny składający się z komory perfuzyjnej, pompy perystaltycznej, natleniacza i pułapki na pęcherzyki powietrza (Rysunek 3). Napełnić układ perfuzyjny 50 mL pożywki hodowlanej, np. Williams' E (Sigma), z dodatkiem 5% płodowej surowicy bydlęcej (Hyclone,), 0,5 U mL-1 insuliny (Eli Lilly), 20 ng mL-1 EGF (Invitrogen), 14 ng mL-1 glukagonu (Bedford Laboratories), 7,5 μg mL-1 hydrokortyzonu (Pharmacia), 100 U mL-1 penicyliny oraz 100 μg mL-1 streptomycyny (Invitrogen).</li>
	<li>Umieścić recelularyzowany przeszczep wątroby w komorze perfuzyjnej i połączyć DLM z układem perfuzyjnym poprzez kaniulę żyły wrotnej podczas pracy pompy z prędkością 5 mL/min, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Aseptycznie zamknąć komorę perfuzyjną i szczelnie ją uszczelnić, aby uniknąć wszelkich wycieków podczas hodowli.</li>
	<li>Przenieść układ perfuzyjny do inkubatora w temperaturze 37oC z zawartością 10% CO2 i zwiększyć prędkość przepływu perfuzyjnego do 15 mL/min.</li>
	<li>Podłączyć natleniacz do zbiornika z mieszaniną gazową 95% O2 i 5% CO2 oraz ustawić przepływ gazu na 0,5 litra/min. Powinno to zapewnić ciśnienie parcjalne tlenu na poziomie około 400 mmHg.</li>
	<li>Hodowlę można kontynuować do 10 dni, dokonując codziennej wymiany pożywki. Można codziennie pobierać próbki pożywki w celu monitorowania funkcji wątroby przeszczepu, takich jak wydzielanie albumin, mocznika i całkowitych kwasów żółciowych. Po zakończeniu okresu hodowli z recelularyzowanego przeszczepu wątroby można pobrać próbki do analizy molekularnej i histologicznej.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Całkowita decelularyzacja wątroby szczura trwa około 72 godzin przy zastosowaniu opisanego protokołu. Powstała macierz zachowuje 100% kolagenu włóknistego, 50% glikozaminoglikanów i jedynie 5% DNA natywnej wątroby (Tabela 1)6. Struktura naczyniowa macierzy zostaje zachowana, co potwierdzono za pomocą odlewania korozyjnego oraz analizy z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej (Rycina 4)6. Obecność mikroarchitektury naczyniowej w DLM ułatwia ponowne zasiedlenie jej komórkami z wydajnością 96% oraz jej późniejszą perfuzję w celu hodowli in vitro. Recelularyzowany przeszczep wątroby może być hodowany in vitro do 10 dni i wykazuje prawidłowe funkcje wątrobowe, co potwierdzono poprzez pomiar wydzielania albuminy, mocznika i całkowitych kwasów żółciowych (Rycina 5)6.
<img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig1.jpg" alt="Inżynieria tkankowa; przygotowanie rusztowania płucnego; ustawienie szalki Petriego; proces decelularyzacji organu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Decelularyzowana macierz wątroby po zakończeniu procesu decelularyzacji. (a) cała wątroba (b) płat środkowy po resekcji.
<img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig2.jpg" alt="Schemat czasu perfuzji; proces wstrzykiwania komórek i inkubacji w eksperymencie z pożywką hodowlaną." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schematyczne przedstawienie recelularyzacji DLM.
<img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig3.jpg" alt="Schemat układu perfuzyjnego z komorą perfuzyjną, pompą perystaltyczną, natleniaczem i pułapką pęcherzyków powietrza." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Konfiguracja układu perfuzyjnego do hodowli in vitro recelularyzowanego przeszczepu wątroby.
<img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig4.jpg" alt="Obrazy mikroskopowe: schemat sieci naczyniowej, tekstury powierzchni SEM, analiza strukturalna dla badania materiałów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Struktura mikro naczyniowa zostaje zachowana w decelularyzowanej macierzy wątroby. Obrazy z odlewów korozyjnych a) prawidłowej wątroby b) wątroby decelularyzowanej, unaczynienie wrotne (czerwone) i żylne (niebieskie). Obrazy z mikroskopii skaningowej elektronowej DLM c) naczynia, d) przekroju zawierającego małe naczynia przypominające przewodowe żółciowe (strzałki), Paski skali (a,b) 5 mm (c,d) 20 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig5.jpg" alt="Porównanie regeneracji wątroby; dane dotyczące albuminy, mocznika i kwasów żółciowych; wykres kultur recelularyzowanych w porównaniu do statycznych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Funkcje specyficzne dla wątroby recelularyzowanego przeszczepu wątroby podczas hodowli perfuzyjnej in vitro. a) sekrecja albuminy (p = 0,5249), b) produkcja mocznika (p = 0,5271) oraz c) całkowita sekrecja kwasów żółciowych (p = 0,0114). Analizę statystyczną różnicy między grupą eksperymentalną a kontrolną przeprowadzono w ciągu 10-dniowego okresu hodowli za pomocą testu Friedmana przy a = 0,01. Słupki błędów reprezentują s.e.m. (n = 3).
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>Świeża wątroba</td>
 <td>Decelularyzowana macierz wątrobowaa</td>
 <td rowspan="2">pwartości p</td>
 <td rowspan="2">% świeżej wątroby</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>n = 4</td>
 <td>n = 8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kolagen</td>
 <td rowspan="2">0.07 ± 0.01</td>
 <td rowspan="2">0.08 ± 0.03</td>
 <td rowspan="2">0.56</td>
 <td rowspan="2">114%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(mg na g wątroby)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glikozaminoglikany</td>
 <td rowspan="2">73.1 ± 6.7</td>
 <td rowspan="2">34.2 ± 2.9</td>
 <td rowspan="2">0.004</td>
 <td rowspan="2">47%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(mg na g wątroby)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kwas deoksyrybonukleinowy</td>
 <td rowspan="2">14.9 ± 5.6</td>
 <td rowspan="2">0.44 ± 0.08</td>
 <td rowspan="2">3.3 10-5</td>
 <td rowspan="2">2.9%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(mg na g wątroby)</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Skład biochemiczny odkomórkowanej macierzy wątrobowej w porównaniu z wątrobą natywną. 
aWartości przedstawiono jako średnia ± s.e.m.

<ol><li>Kulig, K. M., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepatic tissue engineering.</a> Transpl Immunol. 12, 303-310 (2004).</li>
<li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nature biotechnology. 23, 47-55 (2005).</li>
<li>Dahl, S. L., Koh, J., Prabhakar, V., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+native+and+engineered+arterial+scaffolds+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation.</a> Cell Transplant. 12, 659-666 (2003).</li>
<li>Schechner, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+a+vascularized+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Engraftment of a vascularized human skin equivalent.</a> FASEB J. 17, 2250-2256 (2003).</li>
<li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F., F, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).</li>
<li>Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. , (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Opisana tutaj metoda decelularyzacji perfuzyjnej pozwala na otrzymanie rusztowania całej wątroby, które zachowuje taką samą strukturę makroskopową i mikroarchitekturę naczyniową jak wątroba natywna. Rusztowanie to posiada skład macierzy pozakomórkowej zbliżony do naturalnej tkanki wątroby. Metoda recelularyzacji zapewnia wysoką wydajność ponownego zasiedlenia rusztowania komórkami, które pozostają żywe i funkcjonalne podczas testowanego okresu hodowli in vitro. Dzięki wprowadzeniu komórek nieparenchymalnych do r...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/Details.php?ID=2394">Decellularization and Recellularization of Whole Livers</a>. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Nima Saeidi
instead of:
Nima Saedi.

Erratum: Decellularization and Recellularization of Whole Livers

<table><tbody><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Napęd cyfrowy Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Standardowa głowica pompy Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW- 07013-81</td><td></td></tr><tr><td>Pułapka pęcherzykowa</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr></tbody></table>

decelularyzacja i recelularyzacja całych wątrób

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Wątroba jest złożonym organem, który do przetrwania wymaga stałej perfuzji w celu dostarczania składników odżywczych i tlenu oraz usuwania produktów przemiany materii1. Próby odtworzenia lub naśladowania mikrostruktury wątroby metodami od podstaw, z wykorzystaniem inżynierii tkankowej i technik mikrofabrykacji, nie odniosły dotąd sukcesu ze względu na to wyzwanie konstrukcyjne. Ponadto syntetyczne biomateriały stosowane do tworzenia rusztowań w zastosowaniach inżynierii tkankowej wątroby wykazywały ograniczoną zdolność do indukowania regeneracji i naprawy tkanek, w dużej mierze z powodu braku specyficznych motywów wiążących komórki, które indukowałyby odpowiednie funkcje komórkowe2. Z drugiej strony, decelularyzowane tkanki natywne, takie jak naczynia krwionośne3 i skóra4, znalazły wiele zastosowań w inżynierii tkankowej i dostarczyły praktycznego rozwiązania niektórych z tych problemów. Przewagą decelularyzowanej macierzy natywnej jest to, że w pewnym stopniu zachowuje ona oryginalny skład oraz mikrostrukturę, co zwiększa adhezję i reorganizację komórek5.
W niniejszej pracy opisujemy metody perfuzyjnej decelularyzacji wątroby, pozwalające na uzyskanie nienaruszonego bio-rusztowania wątroby, które zachowuje strukturę głównych naczyń krwionośnych. Ponadto opisujemy metody recelularyzacji tych bio-rusztowań przy użyciu dorosłych pierwotnych hepatocytów, co pozwala na stworzenie przeszczepu wątroby funkcjonalnego in vitro, posiadającego dostęp naczyniowy niezbędny do transplantacji in vivo.

Decelularyzacja perfuzyjna jest nowoczesną techniką wytwarzania rusztowań całej wątroby, która zachowuje skład macierzy zewnątrzkomórkowej oraz mikroarchitekturę narządu. W niniejszym opracowaniu opisano metodę przygotowania rusztowań całego narządu z wykorzystaniem decelularyzacji perfuzyjnej i późniejszej repopulacji hepatocytami. Dzięki tej technice możliwe jest wytworzenie funkcjonalnych i możliwych do przeszczepienia graftów wątroby.

Decelularyzacja i recelularyzacja całych wątrób

Wątroba jest złożonym narządem, który do przeżycia wymaga stałej perfuzji w celu dostarczania składników odżywczych i tlenu oraz usuwania produktów przemiany materii1. Podjęte wysiłki w celu...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie zdekularyzowanych przeszczepów wątroby z wykorzystaniem macierzy wątrobowej pozbawionej komórek. Osiąga się to poprzez uprzednią kaniulację wątroby donora. Następnie narząd jest dekomórkowany poprzez perfuzję szeregiem roztworów detergentów.Następnie przeprowadzana jest rewascularyzacja odkomórkowanej macierzy wątrobowej poprzez perfuzyjne wprowadzenie pierwotnych hepatocytów dorosłych. Na koniec, w celu hodowli i recelularyzacji przeszczepu wątroby, stosowany jest system perfuzji in vitro. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące funkcje wątrobowe przeskalowanych przeszczepów in vitro poprzez pomiar wydzielania albumin, mocznika oraz całkowitych kwasów żółciowych do medium perfuzyjnego.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wytwarzanie rusztowań z syntetycznych biomateriałów oraz tradycyjne techniki inżynierii tkankowej, jest w mojej opinii obecność składników macierzy zewnątrzkomórkowej specyficznej dla danej tkanki. Perfuzyjnie zdecelularyzowany rusztowanie posiada również specyficzną dla tkanki mikroarchitekturę, taką jak struktura naczyniowa. Obecność struktury naczyniowej umożliwia nam bardziej jednorodne ponowne wprowadzenie komórek do rusztowania.Umożliwia to również jednorodne perfundowanie go składnikami odżywczymi w celu zwiększenia przeżywalności komórek. Część protokołu dotyczącą zwalniania zostanie zaprezentowana przez Nimę wraz z postdoktorem z naszego laboratorium. Część dotyczącą re-retailizacji zaprezentuje Gabriel Price, który również jest postdoktorem.Jej praca koncentruje się na uprzemysłowieniu tych przeszczepów. Aby przeprowadzić decelularyzację perfuzyjną, należy rozpocząć od pobrania wątroby szczura poprzez kaniulację żyły wrotnej. Używając cewnika 18G, pozostaw otwarte żyłę główną dolną i górną. Organ należy utrzymać w nawilżeniu w roztworze soli fosforanowej (PBS) w 10-centymetrowej szalce Petriego.Następnie należy przygotować system perfuzyjny składający się z ośmiolitrowego zbiornika, pompy perystaltycznej oraz pułapki pęcherzykowej. System perfuzyjny należy wypełnić solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) i pozostawić w działaniu przez 10 minut. Następnie należy wypełnić 10 centymetrową szalkę Petriego PBS i zmniejszyć szybkość przepływu buforu do 1,2 milliliters per minute.Ostrożnie przenieś pobraną wątrobę do szalki Petriego z PBS i pozostaw do perfuzji przez noc. Następnego dnia przeprowadź perfuzję wątroby 0,01% roztworem dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie destylowanej przez pięć minut.Następnie powróć do perfuzji PBS przez jedną godzinę. Powtórz etapy perfuzji SDS i PBS jeszcze trzy razy, zwiększając czas perfuzji SDS do 10, 15, a na koniec do 20 minut. Następnie przeprowadź perfuzję wątroby z następującej serii: 0.01% SDS przez 24 godziny.0,1% SDS przez 24 godziny. 0,2% SDS przez trzy godziny, 0,5% SDS przez trzy godziny. Woda destylowana przez 15 minut, 1% Triton X 100 w wodzie destylowanej przez 30 minut, co usunie wszelkie związane kwasy nukleinowe.I na koniec, przez dwie godziny stosuje się PBS, który w razie potrzeby wypłucze odkomórkowaną macierz wątrobową (DLM) po zakończeniu perfuzji; następnie należy wyciąć wszystkie płaty z wyjątkiem płata środkowego. DLM należy przechowywać w czystej i szczelnie zamkniętej szalce Petriego w PBS w temperaturze 4°C do momentu rozpoczęcia sterylizacji. W celu sterylizacji DLM należy przepłukać ją sterylnym PBS zawierającym 0,1% kwasu nadoctowego i 4% etanolu, a następnie inkubować przez trzy godziny w temperaturze 4°C.Następnie dwa razy przemyj DLM sterylnym PBS. Potem przemyj go PBS zawierającym 2% penicyliny streptomycyny (10 µg/mL) oraz gentamycyny i amfoterycyny B (2,5 µg/mL). Przechowuj odkomórkowaną wątrobę w tym samym roztworze w temperaturze 4 °C do czasu rozpoczęcia eksperymentów z recelularyzacją.Po drugie, należy przeprowadzić recelularyzację zdecelularyzowanej macierzy wątrobowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Należy rozpocząć od przygotowania systemu perfuzyjnego podobnego do tego, który był używany do decelularyzacji wątroby. System perfuzyjny należy wypełnić 200 ml pożywki hodowlanej, takiej jak DMEM z wysoką zawartością glukozy, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 j./ml penicyliny oraz 100 µg/ml streptomycyny.Umieść DLM w komorze perfuzyjnej i podłącz go do systemu perfuzyjnego za pomocą kaniuli żyły wrotnej, podczas gdy pompa pracuje z prędkością 5 ml/min. Aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza, pozwól, aby medium perfundowało DLM przez 30 minut. Następnie zatrzymaj przepływ w systemie perfuzyjnym i powoli wstrzyknij do systemu perfuzyjnego przez pułapkę pęcherzykową 50 milionów hepatocytów wyizolowanych z dorosłego szczura.Wznowić przepływ z prędkością 10 ml/min i rekrykulować medium przez 10 minut. Ponownie zatrzymać przepływ medium. Wstrzyknąć dodatkowe 50 milionów hepatocytów.Następnie ponownie uruchom przepływ z prędkością 10 ml/min. Powtarzaj tę procedurę, aż do momentu wprowadzenia do DLM łącznie 200 milionów hepatocytów. Po wstrzyknięciu wszystkich komórek do DLM, zbierz przelew do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i wiruj przy 800 obr./min przez pięć minut.Odlej nadsączniki i połącz osady w jednej probówce. Oznacz liczbę komórek oraz ich żywotność metodą wykluczania błękitu trypanu. Pozwoli to ustalić wydajność wysiewu do hodowli.Komórkowanie przeszczepu wątroby. Przygotuj sterylną układ perfuzyjny zawierający oksygenator. Napełnij układ perfuzyjny 50 milliliters pożywki hodowlanej, takiej jak Williams E z 5%PBS, oraz 0,5 units per milliliter insuliny.20 ng/mL EGF, 14 ng/mL glukagonu, 7,5 µg/mL hydrokortyzonu, 100 j/mL penicyliny oraz 100 µg/mL streptomycyny. Umieść zdepcelularyzowany przeszczep wątroby w komorze perfuzyjnej i podłącz go do układu perfuzyjnego poprzez kaniulę żyły wrotnej, gdy pompa pracuje z przepływem 5 mL/min.Aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, aseptycznie zamknij komorę perfuzyjną i szczelnie ją uszczelnij, aby zapobiec wyciekom podczas hodowli. Inkubuj system perfuzyjny w temperaturze 37 °C przy 10% CO2 i zwiększ szybkość przepływu perfuzji do 15 mL/min. Podłącz natleniacz do zbiornika z mieszaniną gazów zawierającą 95% O2 i 5% CO2, a następnie ustaw przepływ gazu na 0,5 L/min.Powinno to zapewnić ciśnienie parcjalne tlenu na poziomie około 400 mmHg. Kontynuuj hodowlę do 10 dni, codziennie wymieniając pożywkę. Codziennie pobieraj próbki pożywki w celu oznaczenia wydzielania albumin, mocznika i całkowitych kwasów żółciowych, aby monitorować funkcje wątroby przeszczepu pod koniec okresu hodowli.Pobierz próbki z decelularyzowanego przeszczepu wątroby do analizy molekularnej i histologicznej. Pełna decelularyzacja wątroby szczura trwa około 72 godzin przy zastosowaniu opisanego protokołu.Otrzymana macierz zachowuje 100% kolagenu włóknistego, 50% glikozaminoglikanów i jedynie 5% DNA natywnej wątroby. Struktura naczyniowa macierzy zostaje zachowana, co potwierdzono w analizie z wykorzystaniem odlewania korozyjnego oraz skaningowej mikroskopii elektronowej. Obecność mikroarchitektury naczyniowej w DLM ułatwia ponowne zasiedlenie go komórkami z wydajnością 96% oraz jego późniejszą perfuzję.W przypadku hodowli in vitro, przeszczep wątroby może być hodowany do 10 dni in vitro i wykazuje prawidłowe funkcje wątroby, co potwierdzono poprzez pomiar wydzielania albumin, mocznika i całkowitych kwasów żółciowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić decelularyzację i recelularyzację całej wątroby.

decellularization-and-recellularization-of-whole-livers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Decelularyzacja i recelularyzacja całych wątroib

Badania nad śródbłonkiem sinusoidalnym wątroby (SECs) muszą być prowadzone z wykorzystaniem komórek pierwotnych pobranych od zwierząt, ponieważ nie istnieją linie komórkowe tego typu. Metoda ta opiera się na trawieniu wątroby i centryfugacji różnicowej w celu oczyszczenia SECs do późniejszej hodowli i przeprowadzania eksperymentów.

In vivo endocytoza w wątrobie z następującą puryfikacją komórek wątroby poprzez perfuzję wątroby

Opisano metodę szybkiego i całkowitego usuwania składników komórkowych z nienaruszonego serca świni poprzez wsteczną perfuzję. Metoda ta pozwala uzyskać specyficzne dla miejsca rusztowanie macierzy zewnątrzkomórkowej serca, które może być stosowane w wielu zastosowaniach klinicznych.

Procedura decelularyzacji serca świni przez wsteczną perfuzję wieńcową

Artykuł opisuje metodologię produkcji bezkomórkowej macierzy z jelita szczura. Wyprowadzenie rusztowań jelitowych jest ważne dla przyszłych zastosowań w inżynierii tkankowej, biologii komórek macierzystych i testowaniu leków.

Metodologia decelularyzacji do produkcji naturalnej bezkomórkowej macierzy jelitowej

Decelularyzacja całego narządu tworzy naturalne biologiczne rusztowania, które mogą być wykorzystane w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiono opis modelu regeneracji płuc u naczelnych u zwierząt innych niż człowiek, w którym całe płuca są decelularyzowane, a następnie wysiewane dorosłymi komórkami macierzystymi i komórkami śródbłonka w bioreaktorze ułatwiającym krążenie naczyniowe i wentylację płynnych mediów.

Decelularyzacja i recelularyzacja płuc naczelnych przy użyciu specjalistycznego bioreaktora wielkonarządowego

Przedstawione techniki pobierania wątroby, kaniulacji i perfuzji przy użyciu naszego zastrzeżonego urządzenia umożliwiają zaawansowane ustawienia perfuzji w celu usprawnienia eksperymentów z decelularyzacją i recelularyzacją w wątrobach szczurów.

Procedura decelularyzacji wątroby szczura w urządzeniu do perfuzji o oscylacyjnym ciśnieniu

Ten protokół opisuje decelularyzację nerek szczura Sprague Dawley poprzez wstępną perfuzję detergentów przez układ krwionośny, wytwarzając bezkomórkowe matryce zewnątrzkomórkowe nerek, które służą jako szablony do ponownego zasiedlenia ludzkimi komórkami nabłonka nerkowego. Recelularyzacja i zastosowanie testu perfuzji resazuryny do monitorowania wzrostu odbywa się w specjalnie zaprojektowanych bioreaktorach perfuzyjnych.

Repopulacja komórek nabłonkowych i przygotowanie rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej gryzoni do rozwoju tkanki nerkowej

Recellularna macierz zewnątrzkomórkowa zdecelularizowanej wątroby szczura może być używana jako humanizowany, trójwymiarowy model ex vivo do badania dystrybucji i ekspresji transgenu wirusa lub wektora wirusowego.

Badanie wektorów wirusowych w trójwymiarowym modelu wątroby wypełnionym ludzką linią komórkową raka wątrobowokomórkowego HepG2

Tutaj opisujemy protokół decelularyzacji żyły odpiszczelowej za pomocą detergentów i recelularyzacji przez perfuzję krwi obwodowej i śródbłonka.

Metodologia decelularyzacji i recelularyzacji żył odpiszczelowych człowieka

Ustanawiamy nowatorską technikę chirurgiczną dla modelu perfuzji pojedynczego płata wątroby in vivo u szczurów jako warunek wstępny do dalszych badań in vivo częściowej inżynierii wątroby w przyszłości.

Nowatorska technika chirurgiczna jako podstawa częściowej inżynierii wątroby in vivo u szczurów

Ta metoda umożliwia decelularyzację złożonego stałego organu przy użyciu prostego protokołu opartego na szoku osmotycznym i perfuzji jonowego detergentu przy minimalnym naruszeniu macierzy narządu. Obejmuje on nowatorską technikę decelularyzacji ludzkich serc w woreczku ciśnieniowym z monitorowaniem w czasie rzeczywistym dynamiki przepływu i odpływu zanieczyszczeń komórkowych.

Decellularyzacja całego ludzkiego serca w woreczku ciśnieniowym w orientacji odwróconej

Ten protokół ma na celu decelularyzację serca i płuc myszy. Powstałe w ten sposób rusztowania macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) mogą być barwione immunologicznie i obrazowane w celu zmapowania lokalizacji i topologii ich elementów.

Decelularyzacja mysiego kompleksu krążeniowo-oddechowego

Poznaj metodę decelularyzacji i recelularyzacji całych wątrób w celu inżynierii narządów. Technika ta umożliwia przygotowanie szkieletów macierzy zewnątrzkomórkowej i ich zaludnienie hepatocytami w celu uzyskania funkcjonalnych przeszczepów wątroby.

Decelularyzacja i recelularyzacja całych wątrób

Przeglądaj więcej filmów