Separacja wewnętrznych i zewnętrznych frakcji błonowych bakterii Gram-ujemnych

Zacznij od całkowitej frakcji błonowej bakterii Gram-ujemnej, w tym pęcherzyków błony wewnętrznej i zewnętrznej, zawieszonych w sacharozie o niskiej gęstości, która zachowuje integralność strukturalną.

Aby oddzielić pęcherzyki membranowe, kolejno dodawaj roztwory sacharozy o dużej i średniej gęstości do probówki ultrawirówkowej.

Następnie dodaj frakcję membranową i sacharozę o niskiej gęstości, aby utworzyć nieciągły gradient sacharozy.

Ultrawirować do oddzielania pęcherzyków na podstawie ich gęstości.

Mniej gęste pęcherzyki błony wewnętrznej tworzą warstwę u góry.

Gęstsze pęcherzyki błony zewnętrznej, bogate w lipopolisacharydy i białka, tworzą pasmo na granicy roztworów sacharozy o średniej i dużej gęstości.

Zbierz wewnętrzną warstwę membrany i wyrzuć roztwór gradientu, pozostawiając niewielką ilość.

Następnie zbierz zewnętrzną warstwę membrany.

Dodaj bufor pamięci masowej do każdej frakcji w celu stabilizacji.

Odwirować w celu oddzielenia pęcherzyków i usunięcia supernatantu.

Ponownie zawiesić oczyszczone pęcherzyki membranowe, homogenizować i przechowywać je w niskich temperaturach do dalszej analizy.

Aby przygotować gradient sacharozy, trzymaj polipropylenową lub ultraprzezroczystą rurkę