JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:30 min. • August 29th, 2025
Weź lizat komórek bakteryjnych zawierający składniki komórkowe, w tym sRNA znakowane MS2 związane z docelowym RNA.
sRNA znakowany MS2 jest zaprojektowanym małym regulatorowym RNA przenoszącym pętlę łodygi aptameru MS2 na końcu 5′, która wykazuje wysokie powinowactwo do białka płaszcza wirusowego MS2.
Przenieść lizat bakteryjny do kolumny chromatograficznej o wstępnie zrównoważonym powinowactwie zawierającej żywicę amylozową związaną z białkami fuzyjnymi złożonymi z białka wiążącego maltozę (MBP) i białka płaszcza MS2.
Unieruchomione białko płaszcza MS2 specyficznie wychwytuje pętlę macierzystą aptameru sRNA znakowanego MS2, zachowując nienaruszone docelowe sRNA związane z RNA.
Nieoznakowane cząsteczki, które pozostają niezwiązane, są zbierane w przepływie.
Przemyć kolumnę buforem w celu usunięcia pozostałości niezwiązanych cząsteczek.
Elute za pomocą buforu zawierającego maltozę, która wypiera MBP z żywicy, uwalniając sRNA znakowane MS2 związane z docelowym RNA.
Zbieraj i przechowuj frakcje na lodzie, aby zachować integralność RNA do dalszej analizy.
Zdejmij końcówkę kolumny, a następnie umieść kolumnę chromatograficzną w stojaku na kolumny i umyj kolumnę ultraczystą wodą. Dodać 300 mikrolitrów żywicy amylozowej i przemyć kolumnę 10 mililitrami buforu A. Rozcieńczyć 1, 200 pikamoli białka MBP-MS2 w sześciu mililitrach buforu A i załadować go do kolumny.
Przemyć kolumnę 10 mililitrami buforu A. Następnie przeprowadzić oczyszczanie z powinowactwem MS2. Załaduj lizat komórkowy do kolumny i zbierz frakcję przepływową do czystej probówki zbiorczej. Przemyć kolumnę trzykrotnie 10 mililitrami buforu A i zebrać frakcję płuczką, następnie wymyć kolumnę jednym mililitrem buforu E i zebrać frakcję elucyjną w mikroprobówce o pojemności dwóch mililitrów.
Trzymaj wszystkie zebrane frakcje na lodzie do czasu ekstrakcji RNA.