Metoda mikrorozcieńczania bulionu do badania wrażliwości bakterii Gram-dodatnich na antybiotyki

Wyizoluj kolonie bakterii Gram-dodatnich z płytki hodowlanej i zawieś je w pożywce.

Rozcieńczyć zawiesinę, aby uzyskać optymalne stężenie bakterii do testu.

Zaszczepić studzienki testowe mikropłytki zawierającej rosnące stężenie antybiotyku lipoglikopeptydowego oraz studzienkę kontrolującą wzrost, zawierającą tylko pożywkę.

Rozprowadzić podwielokrotność z dobrze kontrolnej na płytkach hodowlanych w celu sprawdzenia czystości kultury i liczby bakterii.

Inkubuj, aby umożliwić wzrost bakterii, podczas którego syntetyzowana jest ściana komórkowa.

Antybiotyk wiąże się z peptydoglikanem, składnikiem ściany komórkowej i jego prekursorami, hamując polimeryzację i osłabiając ścianę.

Zakłócenie pozwala ciśnieniu osmotycznemu spowodować lizę komórek.

Po inkubacji potwierdzić czystość kultury i optymalną liczbę bakterii.

Sprawdź studzienki pod kątem rozwoju bakterii.

Studzienka kontrolna wykazuje widoczny wzrost, podczas gdy studzienka testowa o najniższym stężeniu antybiotyku, które całkowicie hamuje wzrost, wskazuje minimalne stężenie hamujące (MIC).

W tej demonstracji zostanie zaszczepiona jedna świeżo przygotowana płytka. Aby przygotować inokulum, wybierz kilka dobrze wyizolowanych kolonii z 18-24-godzinnego agatora z krwią lub innej nieselektywnej płytki agarowej. Tutaj stosowane są szczepy kontroli jakości S. aureus i E. faecalis.

Dotknij górnej części każdej kolonii sterylnym wacikiem i przenieś jej część do probówki zawierającej od jednego do pięciu mililitrów CAMHB lub soli fizjologicznej. Kontynuuj przenoszenie, aż zmętnienie zrówna się z 0,5 wzorca McFarlanda w ciągu 15 do 30 minut od przygotowania, rozcieńczyć inokulum jeden do 100 w CAMHB, aby uzyskać końcowe stężenie pięć razy 10 do piątej CFU na mililitr. Dopuszczalny zakres wynosi od dwóch do ośmiu razy od 10 do piątej CFU na mililitr.

Natychmiast za pomocą wielokanałowej pipety ze sterylnymi końcówkami przenieś 50 mikrolitrów końcowego inokulum do każdej odpowiedniej studzienki płytki panelowej MIC. W tym przypadku cztery rzędy są inokulowane każdym z dwóch izolatów, co daje w sumie cztery kontrpróby na izolat. Następnie, aby przeprowadzić kontrolę czystości, użyj pipety, aby przenieść od jednego do 10 mikrolitrów roztworu w pozytywnej kontroli wzrostu do nieselektywnego agaru, takiego jak agar sojowy z tryptykazą z 5% krwią owczą.

Za pomocą sterylnej pętli rozprowadzić roztwór na powierzchni płytki. Obróć płytkę o 90 stopni i ponownie rozprowadź smugi, aby upewnić się, że inokulum jest równomiernie rozprowadzone. Przykryj talerz i odłóż go na bok.

Przygotowując się do zliczania kolonii, za pomocą pipety jednokanałowej przenieś 10 mikrolitrów roztworu ze studzienki kontrolnej wzrostu do 10 mililitrów mieszanki soli fizjologicznej, a następnie przenieś 100 mikrolitrów do odpowiedniego nieselektywnego podłoża agarowego, takiego jak agar sojowy z tryptykazą z 5% krwią owczą za pomocą sterylnej pętli, rozprowadź roztwór na całej powierzchni agaru. Powtórz ten proces dwa razy w różnych kierunkach, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie inokulum. Następnie ułóż do czterech paneli MIC w plastikowym pojemniku, upewniając się, że górny panel jest szczelnie zamknięty pokrywą.

Następnie umieść wilgotny ręcznik papierowy w plastikowym pojemniku i zamknij go szczelnie pokrywką w ciągu 30 minut od zaszczepienia. Panele MIC należy inkubować, płytkę do liczenia kolonii i płytkę kontrolną czystości w inkubatorze z otaczającym powietrzem w temperaturze 35 stopni Celsjusza plus minus dwa stopnie Celsjusza przez 16 do 20 godzin. Następnego dnia odczytaj minimalne stężenie hamujące jako najniższe stężenie, które całkowicie hamuje rozwój bakterii w studzienkach, wykryte gołym okiem.

Określ liczbę kolonii na tabliczce do liczenia kolonii. Pomnóż liczbę policzoną przez współczynnik rozcieńczenia. Na przykład 50 kolonii razy współczynnik rozcieńczenia 10 000 równa się pięć razy 10 piątej CFU na mililitr.

Dopuszczalny zakres wynosi od 20 do 80 kolonii, co odpowiada dwóm do ośmiu razy 10 do piątej kolonii tworzącej jednostki na ml. Stężenie inokulum jest ważną zmienną do kontrolowania badania wrażliwości w celu uzyskania dokładnych wyników. Na koniec sprawdź tabliczkę czystości.

Jeśli wszystkie kolonie są podobne do kolonii używanych jako inokulum, można je uznać za czyste. Jeśli obecne są jakiekolwiek inne kolonie, istnieje możliwość obecności zanieczyszczenia w panelu MIC i badanie należy powtórzyć.