JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:58 min • August 29th, 2025
Weź szkiełko z komorą zawierającą ludzkie komórki nabłonkowe z fluorescencyjnie znakowanymi endosomami.
Wprowadź wewnątrzkomórkowe bakterie chorobotwórcze i inkubuj, pozwalając im przylegać do komórek.
Bakterie wstrzykują białka, które reorganizują cytoszkielet gospodarza, tworząc wypukłości błonowe, które internalizują bakterie w wakuolach.
Te wakuole przedłużają wypustki rurkowe, łącząc się z układem endolizosomalnym, siecią pęcherzyków i organelli regulujących transport wewnątrzkomórkowy.
Projekcje te przekierowują transport pęcherzyków i przebudowują układ endo-lizosomalny.
Umyj w celu usunięcia bakterii zewnątrzkomórkowych, a następnie inkubuj z pożywką zawierającą antybiotyk, aby wyeliminować wszelkie pozostałe bakterie.
Zastąp pożywką do obrazowania bez surowicy zawierającą antybiotyk i dodaj nanocząstki oznaczone kontrastowym fluoroforem.
Inkubować, aby umożliwić wnikanie nanocząstek przez endocytozę i akumulację w przebudowanych pęcherzykach.
Przemyć w celu usunięcia niezinternalizowanych nanocząstek, a następnie inkubować w pożywce do obrazowania uzupełnionej surowicą.
Fluorescencyjne nanocząstki i znakowane endosomy umożliwiają wizualizację indukowanej przez bakterie endo-lizosomalnej przebudowy.
Aby rozpocząć tę procedurę, zmierz OD 600 subkulturowanych bakterii i rozcieńcz do OD 600 0,2 w jednym mililitrze PBS, dodaj odpowiednie ilości bakterii do komórek HeLa w 8-dołkowym szkiełku komorowym, aby osiągnąć wielokrotność infekcji 100. Inkubować przez 30 minut w inkubatorze komórkowym.
Umyj komórki HeLa trzykrotnie PBS, aby usunąć niezinternalizowane bakterie. Ten punkt czasu jest ustawiony jako godzina zero po infekcji lub godzina zero p.i. Dodaj 300 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej zawierającej 100 mikrogramów na mililitr gentamycyny do komórek i utrzymuj przez godzinę.
Po godzinie zastąpić pożywkę pożywką obrazową zawierającą 10 mikrogramów na mililitr gentamycyny. Dodaj NP złota-BSA-rodaminy do komórek HeLa, aby uzyskać końcowe stężenie OD 520 wynoszące 0,1.
Inkubować przez godzinę. Po godzinie usuń podłoże i przemyj trzykrotnie PBS. Na koniec dodaj 300 mikrolitrów świeżej pożywki obrazowej zawierającej 10 procent FCS i 10 mikrogramów na mililitr gentamycyny przez resztę czasu inkubacji.