Hodowla prątków gruźlicy w warunkach ograniczonych żelazem

Zacznij od płytki agarowej zawierającej kolonie Mycobacterium tuberculosis wyhodowane na pożywce wzbogaconej w składniki odżywcze.

Zaszczepij pojedynczą kolonię w bulionie uzupełnionym składnikami odżywczymi i inkubuj z mieszaniem, aby uzyskać równomierny wzrost.

Pozwól hodowli osiągnąć późną fazę logarytmiczną, w której komórki są metabolicznie aktywne.

Odpipetuj niewielką objętość na wzbogaconą płytkę agarową, rozprowadź ją równomiernie i inkubuj, aż utworzy się ciągła warstwa bakteryjna.

Zwilż sterylny wacik minimalnym podłożem o niskiej zawartości żelaza (LIMM) i zbierz bakterie.

Zawieś je w plastikowym pojemniku zawierającym LIMM, aby uniknąć zanieczyszczenia żelazem.

Dodaj środek dyspergujący, aby zapobiec zbrylaniu się i inkubować bez wstrząsania.

W warunkach ograniczających żelazo bakterie aktywują reakcje stresowe i wytwarzają siderofory w cytoplazmie.

Są one pakowane w pęcherzyki zewnątrzkomórkowe i uwalniane do otoczenia.

Siderofory wychwytują żelazo i pomagają bakteriom przetrwać.

System ten podkreśla adaptację i przeżycie prątków w warunkach ograniczonych poziomem żelaza

Zaszczepić pojedynczą kolonię MTB w dwóch mililitrach pożywki bulionowej prątków uzupełnionej wzbogaceniem ADN. Inkubować z mieszaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy widoczny jest wzrost, ekstrahować dwa mililitry kultury i zmierzyć OD 540 na spektrofotometrze.

Przerwij inkubację, gdy OD 540 osiągnie 0,8, co wskazuje na późną fazę logarytmiczną. Rozprowadzić 200 mikrolitrów późnej kultury logarytmicznej na płytkach agarowych prątków uzupełnionych 0,2 glicerolu, 0,5% Tween 80 i ADN. Zaszczepić co najmniej pięć płytek.

Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. A po tygodniu wzrost bakterii jest widoczny jako zlewająca się warstwa. Następnie zwilż sterylny bawełniany wacik w minimalnym podłożu o niskim poziomie żelazka.

Użyj tego wacika, aby zebrać bakterie z płytek agarowych. Zaszczepij bakterie w 100 mililitrach pożywki o minimalnej zawartości żelaza w probówce. Zebrać wystarczającą ilość bakterii, aby przygotować zawiesinę o średnicy zewnętrznej 540 jednego.

Rozcieńczyć zawiesinę 10 razy do jednego litra minimalnym podłożem o niskiej zawartości żelaza i podzielić ją na dwie sterylne plastikowe butelki. Następnie przenieś dwa mililitry kultury do pięciomililitrowej probówki hodowlanej. Dodać 10 mikrolitrów tyloksapolu o stężeniu 10% objętości.

Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 14 dni.