$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Weźmy hodowlę Mycobacterium tuberculosis wyhodowaną w pożywce ograniczającej żelazo, aby zwiększyć wydzielanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zawierających siderofory, chelator żelaza.
Wirówka do granulowania bakterii.
Zebrać supernatant i przefiltrować go, aby usunąć resztki bakterii.
Przenieś filtrat do mieszanego systemu ultrafiltracji i przefiltruj w celu usunięcia nadmiaru pożywki i skoncentrowania EV.
Odwirować koncentrat w celu osadzenia resztek komórkowych.
Przenieść supernatant do probówki ultrawirówkowej i odwirować w celu zebrania granulatu EV.
Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w buforze i wymieszać go ze stężonym podłożem o gradiencie gęstości, aby utworzyć dolną warstwę.
Nałożenie ze zmniejszającymi się stężeniami ośrodka gradientowego w celu utworzenia nieciągłego gradientu gęstości.
Dodaj bufor na górze i odwiruj. Pojazdy elektryczne migrują do warstwy, która odpowiada ich gęstości wyporu.
Zbierz każdą frakcję w osobnej probówce.
Oczyszczona frakcja z EV zawierającymi syderofory jest gotowa do dalszych badań.
Przenieś kulturę do pięciu stożkowych probówek wirówek o pojemności 225 mililitrów i odwiruj przy 2,850 razy g przez siedem minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Zebrać supernatant kultury za pomocą pipety o pojemności 50 mililitrów i przefiltrować, wysterylizować przez filtr 0,22 mikrona.
Aby wyizolować MEV, należy przenieść filtrat hodowlany do systemu ultrafiltracji z mieszanymi komórkami umieszczonego w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przefiltrować koncentrat pod ciśnieniem mniejszym niż 50 PSI przez membranę odcinającą o mocy 100 kilodaltonów. Następnie odwirować skoncentrowany filtrat kulturowy pod ciśnieniem 15 000 razy g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant w probówkach do ultrawirowania poliwęglanu. Odwirować supernatant w temperaturze 100 000 g przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić błoniaste granulki w sumie w jednym mililitrze sterylnego PBS przez delikatne pipetowanie. Wymieszaj 0,5 mililitra zawiesiny granulek z 1,5 mililitra 60% roztworu jodiksanolu na dnie cienkościennej probówki ultrawirówki z polipropylenu. Nałóż tę zawiesinę MEV jodixanol 45% na jeden mililitr roztworów 40%, 35%, 30%, 25% i 20% jodiksanolu oraz jeden mililitr PBS na górze.
Wirować z prędkością 100 000 g przez 18 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie użyj jednomililitrowej strzykawki Hamiltona, aby zebrać jednomililitrowe frakcje gradientu gęstości, zaczynając od góry. Rozcieńczyć każdą zebraną frakcję do 20 mililitrów PBS i odwirować z prędkością 100 000 razy g przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 0,5 mililitra PBS.