Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Zacznij od zaszczepienia kolonii genetycznie zmodyfikowanych bakterii w płynnym pożywce.

Bakterie te wyrażają fluorescencyjne białko fuzyjne w błonie zewnętrznej, zewnętrznej warstwie ochronnej.

Inkubuj, aby bakterie uwolniły pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), nanostruktury związane z błoną biorące udział w komunikacji międzykomórkowej, które zawierają białko fluorescencyjne.

Przenieś kulturę do butelki i odwiruj z niską prędkością, aby osadzać komórki.

Przenieś supernatant zawierający EV, białka komórkowe i szczątki komórkowe. Odwirować z dużą prędkością i usunąć supernatant zawierający zanieczyszczenia.

Przefiltrować supernatant przez membranę, aby wyeliminować wszelkie pozostałe bakterie i zanieczyszczenia.

Zaszczepić próbkę na agarze i inkubować ją. Brak tworzenia kolonii bakteryjnych potwierdza brak bakterii.

Przenieś roztwór do urządzenia ultrafiltracyjnego z półprzepuszczalną membraną i odwiruj, aby wychwycić EV, jednocześnie eliminując mniejsze białka.

Zbierz skoncentrowane EV w probówce do dalszej analizy.

Zacznij od zaszczepienia pojedynczych kolonii Escherichia coli w 250 do 1000 mililitrach bulionu Luria-Bertani lub LB, używając sterylnej pętli. Następnie inkubuj kulturę tlenowo w inkubatorze z wytrząsaniem przy 300 obrotach na minutę i 37 stopniach Celsjusza. Po 48 godzinach inkubacji sklaruj pożywkę bakteryjną, przenosząc kultury komórkowe do czystych 500-mililitrowych polipropylenowych butelek wirówkowych w celu odwirowania w wirniku o dużej pojemności o stałym kącie nachylenia w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 5,000 razy G przez 15 minut.

Przenieść supernatant do czystych butelek wirówkowych, ostrożnie wlewając do wirówki w temperaturze 10 000 razy G przez 15 minut. Następnie przenieś supernatant do 0,2-mikronowego urządzenia filtrującego z polieterosiulfonu o odpowiedniej wielkości i podłącz urządzenie filtrujące do ściennego źródła podciśnienia. Jeśli szybkość filtracji znacznie spadnie, przenieś niefiltrowany materiał do nowego urządzenia.

Przefiltrowane podłoże może być przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc lub może być natychmiast poddane dalszej obróbce. W celu sprawdzenia, czy komórki zdolne do życia zostały całkowicie usunięte, należy rozprowadzić porcję przefiltrowanego supernatantu na odpowiednich płytkach agarowych i upewnić się, że po inkubacji w warunkach optymalnych dla szczepu bakteryjnego nie ma żadnych kolonii. W celu zagęszczenia przefiltrowanej pożywki o objętości 100 mililitrów, załaduj 90 mililitrów przefiltrowanej pożywki hodowlanej do zbiornika odśrodkowego urządzenia do ultrafiltracji z odcięciem masy cząsteczkowej 100 kilodaltonów i odwiruj pożywkę w wahadłowym wirniku kubełkowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 2,000 razy G przez 15 do 30 minut, aż objętość pożywki w górnym zbiorniku zostanie zagęszczona do mniej niż 0,5 mililitra.

Aby uzupełnić zbiornik pozostałą przefiltrowaną pożywką hodowlaną, usuń przepływ z dna urządzenia w celu ponownego zrównoważenia. Jeśli lepkość zagęszczonego podłoża w zbiorniku jest widocznie zwiększona, należy rozcieńczyć pożywkę PBS i ponownie zagęścić przez odwirowanie, aby zredukować wszelkie pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub białka EV mniejsze niż granica masy cząsteczkowej wynosząca 100 kilodaltonów. Następnie przenieś skoncentrowaną pożywkę do niskobiałkowej probówki wiążącej, aby przechowywać ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.