$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Weź chromatografię wykluczania wielkości lub kolumnę SEC wypełnioną porowatymi kulkami żywicy o określonym rozmiarze. Na górze znajduje się zbiornik na próbki.
Dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS w celu zrównoważenia kulek kolumny i odrzucić przepływ.
Załaduj skoncentrowany filtrat kultur bakteryjnych, który zawiera pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub EV, wydzielane białka i zanieczyszczenia.
EV to nanopęcherzyki na bazie lipidów, które przenoszą bioaktywne cząsteczki i są wydzielane przez bakterie.
Gdy filtrat dostanie się do kulek, dodaj PBS, aby przepuścić go przez złoże żywicy.
Odrzucić początkowy eluat zawierający duże zanieczyszczenia niepęcherzykowe.
Umieść probówkę zbiorczą pod wylotem i sekwencyjnie dodawaj PBS.
Duże EV unikają mniejszych porów żywicy, przemieszczają się przez przestrzenie międzycząsteczkowe między kulkami i najpierw eluują.
Mniejsze białka i zanieczyszczenia dostają się do porów, podążają dłuższymi ścieżkami i wymywają się później.
Zbierz wcześnie eluujące frakcje zawierające EV i przechowuj je do analizy.
W celu wyizolowania EV należy przeprowadzić chromatografię wykluczania wielkości lub SEC, używając małej kolumny z 10-mililitrową objętością złoża dla mniej niż 100 mililitrów materiału wyjściowego i większej kolumny z 47-mililitrową objętością złoża dla ponad 100 mililitrów materiału wyjściowego. Na kilka godzin przed eksperymentem doprowadź kolumnę SEC i PBS do temperatury pokojowej, a następnie ustabilizowaj kolumnę w pozycji pionowej za pomocą standardowego stojaka laboratoryjnego i uchwytu. Przed podłączeniem do kolumny SEC należy uwodnić zbiornik próbki, pozwalając pięciu mililitrom PBS przepłynąć przez frytę do pojemnika na odpady.
Następnie odkręć korek wlotowy kolumny, aby dodać dwa mililitry PBS do zbiornika próbki i ostrożnie podłącz zbiornik do kolumny, gdy PBS kapie przez frytę. W celu zrównoważenia kolumny dodaj 47 mililitrów PBS do zbiornika próbki, a następnie odkręć dno kolumny SEC. Następnie pozwól, aby cały załadowany bufor próbki przepłynął przez kolumnę i odrzuć przepływ.
Po załadowaniu dwóch mililitrów próbki do zbiornika na próbkę, pozwól, aby próbka całkowicie weszła do kolumny i zbierz przepływ. Natychmiast dodać PBS do zbiornika na próbkę w objętości 14,25 mililitra minus objętość próbki, aby umożliwić przepływ roztworu przez kolumnę, odrzucając ilość równą objętości pustej kolumny. Następnie umieść dwumililitrową mikroprobówkę o niskim poziomie wiązania bezpośrednio pod kolumną SEC, aby zebrać pierwszy przepływ lub frakcję pierwszą po przepuszczeniu dwóch mililitrów PBS przez kolumnę.
Kontynuuj dodawanie dwóch mililitrów PBS do zbiornika próbki, aby zebrać każdą kolejną frakcję. Zebrane frakcje należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub minus 80 stopni Celsjusza w przypadku długotrwałego przechowywania.