JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:05 min. • September 26th, 2025
Zacznij od studzienek zawierających limfocyty T CD4 + eksprymujące receptory specyficzne dla peptydu owoalbuminy lub OVAp.
W studzience kontroli ujemnej umieść porowatą wkładkę membranową.
W probówce weź komórki dendrytyczne zakażone bakteriami i załadowane OVAp w celu prezentacji powierzchniowej.
Dodać komórki dendrytyczne bezpośrednio do studzienki testowej i do wkładki w studzience kontroli ujemnej.
Dodaj pożywkę do studzienek i inkubuj.
W dołku testowym komórki oddziałują na siebie, tworząc synapsę immunologiczną, ułatwiając przenoszenie bakterii z komórki dendrytycznej do komórki T, proces znany jako transinfekcja.
W studzience kontroli ujemnej bariera błonowa zapobiega interakcji komórka-komórka, hamując w ten sposób transinfekcję.
Dodaj antybiotyk gentamycynę do studzienek i inkubuj.
Gentamycyna nie może przenikać do komórek eukariotycznych, zabijając w ten sposób tylko bakterie niezinternalizowane, podczas gdy bakterie zinternalizowane przeżywają.
Próbka testowa zawierająca zakażone limfocyty T oraz próbka kontrolna z niezakażonymi limfocytami T są teraz gotowe do izolacji limfocytów T i ilościowego określenia transinfekcji.
Do 24-dołkowej płytki hodowlanej dodaj dwa miliony limfocytów T CD4 + w objętości 0,5 mililitra do każdego z pięciu dołków.
Następnie, aby kontrolować kontakt fizyczny, umieść poliwęglanowe bariery trans-studzienkowe o wielkości porów trzech mikrometrów w trzeciej i czwartej studzience. Do pierwszej studzienki dodaj 0,1 mililitra zainfekowanych przeciążonych komórek dendrytycznych. Do drugiej studzienki dodaj 0,1 mililitra zainfekowanych, nieobciążonych komórek dendrytycznych.
Dodaj 0,1 mililitra zainfekowanych, przeciążonych komórek dendrytycznych do jednej studzienki i 0,1 mililitra zainfekowanych, nieobciążonych komórek dendrytycznych do drugiej studzienki. Wreszcie, jako kontrola ujemna, bezpośrednio zainfekuj piątą studzienkę limfocytów T CD4 + przy MOI 10. Następnie zwiększ całkowitą objętość studni do 0,6 mililitra za pomocą RPMI.
Inkubuj płytkę przez 30 minut, aby umożliwić utworzenie synaps immunologicznych. Po inkubacji dodać 100 mikrogramów gentamycyny na mililitr pożywki do każdej studzienki i inkubować przez godzinę. Gentamycyna jest antybiotykiem aminoglikozydowym, który nie jest w stanie przeniknąć do komórek eukariotycznych.
Dlatego na tym etapie aminoglikozyd zabije bakterie zewnątrzkomórkowe, ale nie bakterie wewnątrzkomórkowe.