Analiza in vivo zakażeń bakteryjnych związanych z implantami przy użyciu zarodków danio pręgowanego

Zacznij od naczynia zawierającego komorę agarozową uformowaną z rowkami.

W każdym rowku znajdują się znieczulone zarodki danio pręgowanego zanurzone w pożywce zarodkowej uzupełnionej środkiem znieczulającym.

Pod mikroskopem świetlnym wprowadzić igłę do mikroiniekcji w tkankę mięśniową.

Wstrzyknąć zawiesinę zawierającą S. aureus i mikrosfery polistyrenu w celu modelowania infekcji związanej z implantem.

Przenieść wstrzyknięte zarodki do pojedynczych dołków na płytce wielodołkowej wypełnionej świeżą pożywką i inkubować.

Mikrosfery oferują fizyczną powierzchnię, która wspomaga kolonizację bakteryjną i sprzyja infekcji.

Aby ocenić infekcję bakteryjną związaną z implantem, należy przenieść każdy zarodek do osobnej probówki i przemyć go buforem. Dodaj bufor i koraliki ceramiczne.

Homogenizować w celu lizy zarodków i uwolnienia zawartości wewnętrznej, w tym bakterii.

Płytkować rozcieńczone homogenaty, a następnie inkubować, aby umożliwić utworzenie kolonii.

Zarodki, którym wstrzyknięto zawiesinę mikrosferyczno-bakteryjną, wykazują wyższą liczbę kolonii niż te, którym wstrzyknięto samą zawiesinę bakteryjną. Wskazuje to, że mikrosfery zwiększają podatność na infekcje.

Po odczekaniu pięciu minut na znieczulenie zarodków, należy ustawić zarodki w rowkach w jednej orientacji do ich wstrzyknięcia. Ustawić mikrowstrzykiwacz na odpowiednie ustawienia wstrzyknięcia i wprowadzić igłę do tkanki mięśniowej pierwszego zarodka pod kątem 45 do 60 stopni pod mikroskopem stereoskopowym.

Delikatnie przesuwaj igłę do przodu i do tyłu, aby w razie potrzeby dostosować położenie w tkance, a następnie użyj pedału nożnego mikrowstrzykiwacza, aby wstrzyknąć obciążoną zawiesinę. Podczas wstrzykiwania zawiesiny mikrosfery bakteryjnej do tkanki zarodków danio pręgowanego, igłę należy wprowadzać delikatnie, ale pewną ręką. Po udanym włożeniu, przed wstrzyknięciem należy stworzyć miejsce na materiały.

I utrzymuj zarodki w pożywce E3 bez tricainy w indywidualnych dołkach 48-dołkowych płytek z codzienną zmianą podłoża. Aby monitorować postęp infekcji poprzez kwantyfikację jednostek tworzących kolonie, losowo przenieś pięć do sześciu zdolnych do życia zakażonych zarodków do pojedynczych dwumililitrowych mikroprobówek wkrótce po wstrzyknięciu i delikatnie umyj zarodki sterylnym PBS. Po wyrzuceniu popłuczyn dodaj 100 mikrolitrów sterylnego PBS do każdej probówki, a następnie dwa do trzech sterylnych kulek cyrkonu o średnicy dwóch milimetrów.

Następnie zmiażdżyć zarodki w homogenizatorze z prędkością 3500 obr./min przez 30 sekund i wyhodować homogenat, jak pokazano.