JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:48 min • September 26th, 2025
Weźmy kuwetę zawierającą roztwór roboczy tioflawiny T, barwnika fluorescencyjnego specyficznego dla amyloidu, rozpuszczonego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.
Umieść kuwetę w spektrofluorometrze i zarejestruj podstawowy sygnał fluorescencji.
Wstrzymaj skanowanie i wyjmij kuwetę.
Dodać wysterylizowany filtrem supernatant hodowlany pobrany z komórek śródbłonka płuc zakażonych zjadliwymi bakteriami Pseudomonas .
Supernatant zawiera agregaty amyloidowe, które są nieprawidłowo sfałdowanymi, bogatymi w arkusze beta białkami.
Delikatnie wymieszaj zawartość przez odwrócenie, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie.
Ponownie załaduj kuwetę do spektrofluorometru i wznów skanowanie, aby uzyskać sygnał fluorescencyjny oparty na czasie.
Tioflawina T wiąże się specyficznie z amyloidami bogatymi w arkusze beta, co prowadzi do zwiększonej fluorescencji.
Wykonaj skan fluorescencyjny przy użyciu tych samych ustawień.
Wzrost fluorescencji w stosunku do wartości wyjściowej wskazuje na obecność i względną obfitość amyloidów wywołanych infekcją w supernatancie hodowli.
Aby określić ilościowo zawartość amyloidów w supernatancie, dodaj 20 mikrolitrów świeżo przygotowanego i przefiltrowanego 50-krotnego roztworu podstawowego tioflawiny T do jednego mililitra PBS w jednomililitrowej kuwecie spektrofotometru i załaduj rozcieńczoną próbkę do spektrofluorometru.
Zmierz bazową emisję fluorescencji za pomocą wzbudzenia 425 nanometrów. Skanowanie emisji fluorescencji od 450 do 575 nanometrów w krokach co dwa nanometry. Następnie ustaw instrument tak, aby wykonywał skanowanie poklatkowe przy użyciu wzbudzenia 425 nanometrów i emisji 482 nanometrów z akwizycją danych co 0,2 sekundy przez 60 sekund.
Wstrzymaj skanowanie po 20 sekundach i dodaj 10 mikrolitrów supernatantu wysterylizowanego filtrem do kuwety. Po wymieszaniu przez odwrócenie ponownie załaduj kuwetę do spektrofluorometru i wznów skanowanie oparte na czasie przez ostatnie 40 sekund. Po zakończeniu upływu czasu wykonaj końcowe skanowanie widma emisji fluorescencji, korzystając z oryginalnych ustawień skanowania.