JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:27 min. • September 26th, 2025
Rozpocznij od hodowli rekombinowanego Pseudomonas aeruginosa w pożywce selekcyjnej antybiotykowej.
Bakterie te są siedliskiem niereplikacyjnego plazmidu zintegrowanego z genomem w pobliżu bakteryjnego genu docelowego przeznaczonego do delecji.
Integracja zaszła za pomocą sekwencji homologicznych wspólnych dla plazmidu i genomu, co doprowadziło do pojedynczej rekombinacji krzyżowej.
Plazmid koduje gen oporności na antybiotyki i gen sacB , który nadaje wrażliwość na sacharozę.
Umieść bakterie na pożywce zawierającej sacharozę, ale pozbawionej antybiotyku i inkubuj.
Bez ciśnienia antybiotyku zachodzi druga rekombinacja lub podwójne skrzyżowanie między regionami homologicznymi, wycinając plazmid i gen docelowy.
Podczas namnażania się bakterii wycięty plazmid nie jest przekazywany dalej, dzięki czemu bakterie tolerują sacharozę.
Umieścić bakterie na pożywce nieselektywnej i pożywce zawierającej sacharozę lub antybiotyk i inkubować.
Wzrost na pożywce nieselektywnej i sacharozowej, ale nie na pożywce antybiotykowej, potwierdza udane podwójne skrzyżowanie.
Zacznij od wyhodowania pojedynczych, rekombinowanych kolonii w Pseudomonas Isolation Broth lub PIB. Zaszczepić i rozsypać 10 mikrolitrów każdej kultury na wstępnie podgrzanych płytkach PIA, uzupełnionych 10% sacharozą. Następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnego dnia wyjmij płytki z inkubatora i sprawdź je pod kątem wzrostu. Kolonia odporna na sacharozę powinna być rekombinantami podwójnie krzyżującymi. Użyj sterylnych wykałaczek, aby załatać co najmniej 20 kolonii na wstępnie podgrzanych płytkach PIA, PIA uzupełnionej 10% sacharozą i PIA uzupełnionej karbenicyliną.
Inkubuj płytki przez noc i zbadaj je pod kątem wzrostu następnego dnia. Prawdziwe rekombinanty z podwójnym krzyżowaniem będą wrażliwe na karbenicylinę i sacharozę.