Generowanie podwójnie krzyżowanych rekombinantów Pseudomonas aeruginosa w celu celowanej delecji genów

Rozpocznij od hodowli rekombinowanego Pseudomonas aeruginosa w pożywce selekcyjnej antybiotykowej.

Bakterie te są siedliskiem niereplikacyjnego plazmidu zintegrowanego z genomem w pobliżu bakteryjnego genu docelowego przeznaczonego do delecji.

Integracja zaszła za pomocą sekwencji homologicznych wspólnych dla plazmidu i genomu, co doprowadziło do pojedynczej rekombinacji krzyżowej.

Plazmid koduje gen oporności na antybiotyki i gen sacB , który nadaje wrażliwość na sacharozę.

Umieść bakterie na pożywce zawierającej sacharozę, ale pozbawionej antybiotyku i inkubuj.

Bez ciśnienia antybiotyku zachodzi druga rekombinacja lub podwójne skrzyżowanie między regionami homologicznymi, wycinając plazmid i gen docelowy.

Podczas namnażania się bakterii wycięty plazmid nie jest przekazywany dalej, dzięki czemu bakterie tolerują sacharozę.

Umieścić bakterie na pożywce nieselektywnej i pożywce zawierającej sacharozę lub antybiotyk i inkubować.

Wzrost na pożywce nieselektywnej i sacharozowej, ale nie na pożywce antybiotykowej, potwierdza udane podwójne skrzyżowanie.

Zacznij od wyhodowania pojedynczych, rekombinowanych kolonii w Pseudomonas Isolation Broth lub PIB. Zaszczepić i rozsypać 10 mikrolitrów każdej