Fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe cyklu życiowego Streptomyces venezuelae

Weź płytkę mikroprzepływową ze studzienką zawierającą zarodniki Streptomyces venezuelae, bakterii tworzącej strzępki.

Inne wyznaczone studnie zawierają albo bogate w składniki odżywcze, albo zużyte podłoże.

Zarodniki pochodzą ze szczepu eksprymującego fluorescencyjne białka DivIVA i FtsZ, które lokalizują się odpowiednio na końcach strzępek i ściankach poprzecznych.

Nałóż olejek immersyjny na soczewkę obiektywu odwróconego mikroskopu i na okienko obrazowania płytki.

Zamontuj płytkę na stoliku mikroskopu i rozpocznij obrazowanie poklatkowe.

Załaduj zarodniki do komory hodowlanej na płytce.

Następnie wprowadź pożywkę bogatą w składniki odżywcze, aby zainicjować kiełkowanie zarodników.

W miarę wzrostu strzępek DivIVA gromadzi się na końcach strzępek, podczas gdy FtsZ tworzy rozproszone pierścienie na ścianach poprzecznych.

Następnie przełącz się na zużyte medium. Brak składników odżywczych w tej pożywce wspomaga zarodnikowanie.

W kiełkujących strzępkach ogniska DivIVA znikają, a FtsZ reorganizuje się w regularną drabinę pierścieni podziałowych, tworząc przegrody zarodnikowe.

Z biegiem czasu zanik fluorescencji FtsZ w tych samych strzępkach potwierdza zakończenie zarodnikowania.

Wcześniej podgrzej komorę środowiskową do 30 stopni Celsjusza.

Następnie włącz mikroskop i oprogramowanie sterujące mikroskopem. Umieść na miejscu obiektyw immersyjny z olejkiem o dużej aperturze numerycznej i upewnij się, że odpowiednie filtry i lustra schematyczne ustawione do uzyskiwania obrazów kontrastu interferencyjnego różnicowego, wraz z obrazami fuzji białek żółtego fluorescencyjnego i czerwonego fluorescencyjnego, są na swoim miejscu. Umieść kroplę olejku immersyjnego w obiektywie i na dole okienka obrazowania na płytce mikroprzepływowej.

Ostrożnie zamontuj szczelne urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu odwróconego i zabezpiecz je na miejscu. Użyj osadzonych znaczników pozycji, aby ustawić ostrość okna obrazowania komory hodowli mikroprzepływowej. Skoncentruj się na skrajnej lewej części pierwszej komory przepływowej oznaczonej jako A, a następnie przesuń stolik do rozmiaru piątego, odpowiadającego wysokości pułapki 0,7 mikrometra.

W oprogramowaniu mikroprzepływowym ustaw system tak, aby ładował komórki z ósmej studni wlotowej przy czterech psi przez 15 sekund. Po uruchomieniu procesu sprawdź gęstość komórek w komorze hodowlanej, przesuwając stolik po oknie obrazowania. Jeśli żadne zarodniki nie zostały uwięzione, powtórz etap ładowania komórek lub alternatywnie zwiększ ciśnienie ładowania i/lub czas, aż zostanie osiągnięta pożądana gęstość komórek od jednego do 10 zarodników na okno obrazowania.

Uważaj, aby nie przeciążyć komory hodowlanej. Następnie uruchom przygotowany wcześniej program przepływu w oprogramowaniu sterującym i pozwól płytce mikroprzepływowej na zrównoważenie ciepła przez godzinę na etapie mikroskopu przed rozpoczęciem akwizycji obrazu. W oprogramowaniu sterującym mikroskopem skonfiguruj wielowymiarową akwizycję, aby z czasem wykonać wiele obrazów w wielu pozycjach etapu, najpierw określając katalog do automatycznego zapisywania plików obrazów.

Następnie przejdź do ustawień oświetlenia i wprowadź z góry określone optymalne ustawienia oświetlenia dla każdej konkretnej konstrukcji. Następnie skonfiguruj szereg czasowy, aby pobierać obrazy co 40 minut przez 24 godziny. Aby określić pozycje stolika i ustawić autofokus, zeskanuj komorę hodowlaną i zapisz pozycje stolika dla każdej pozycji obrazowania, która Cię interesuje.

Upewnij się, że pozycje jednostopniowe są umieszczone wystarczająco daleko od siebie, aby zminimalizować wybielanie fotograficzne i fototoksyczność. Po zweryfikowaniu współrzędnych Z wybranych pozycji stolika aktywuj sprzętowy autofokus. Następnie rozpocznij eksperyment poklatkowy w oprogramowaniu sterującym mikroskopem.

Przerwij akwizycję obrazu po 24 do 30 godzinach lub gdy strzępki w obszarze zainteresowania zróżnicują się w zarodniki. Następnie zatrzymaj program przepływu w oprogramowaniu i zdemontuj urządzenie mikroprzepływowe. Przygotuj zużytą płytkę mikroprzepływową do krótkotrwałego przechowywania, usuwając pozostałą pożywkę ze studzienek wlotowych, studzienki odpływowej i studzienki załadowczej komórki.

Następnie wypełnij używane studzienki na pasie A i studzienki nieużywanych pasów sterylnym PBS. Na koniec uszczelnij płytkę folią gruszkową, aby zapobiec jej wysychaniu. I przechowuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.