Monitorowanie infekcji bakteryjnej i dostarczania białek efektorowych w komórkach roślinnych

Zacznij od eksperymentalnej rośliny z genetycznie zmodyfikowanymi regionami liści wykazującymi ekspresję dużych niefluorescencyjnych fragmentów superfoldera białka zielonej fluorescencji lub sfGFP.

Wstrzyknąć te zmodyfikowane obszary za pomocą bakterii Pseudomonas zawierających białka efektorowe oznaczone małym niefluorescencyjnym fragmentem sfGFP.

Inkubuj, aby umożliwić interakcję między bakteriami a komórkami liści.

Korzystając ze specjalistycznego systemu wydzielania, Pseudomonas dostarcza oznakowane białka efektorowe do cytozolu liścia.

Bliskość między dużymi i małymi fragmentami GFP umożliwia ich składanie się w funkcjonalny fluorescencyjny sfGFP, który następnie przemieszcza się do błony plazmatycznej.

Po inkubacji należy wyciąć krążki liściowe z wstrzykniętych obszarów.

Wizualizuj te dyski za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Początkowo zobrazuj dysk liścia przy niskiej intensywności lasera, aby zminimalizować autofluorescencję. Następnie zwiększ moc lasera, aby poprawić widoczność.

Zielona fluorescencja potwierdza udaną infekcję bakteryjną i dostarczenie białka efektorowego do komórek roślinnych.

W przypadku liści Nicotiana benthamiana należy naciekać zawiesinę Pseudomonas w tym samym obszarze, w którym Agrobacterium zostało naciekane dwa dni wcześniej.

Na koniec wytnij krążek liściowy z liści zaszczepionych przez Pseudomonas. W określonych punktach czasowych po infiltracji Pseudomonas użyj konfokalnego systemu skanowania laserowego, aby zobrazować dwa, dwa centymetry kwadratowe dyski liściowe z jednej rośliny. Obserwuj komórki z dala od otworu infiltracyjnego, aby uniknąć martwych komórek zabitych przez zranienie.

Translokowane efektory z bakterii są obecne tylko w bardzo małych ilościach. Dlatego możesz zwiększyć moc lasera i uzyskać emisję fluorescencji, aby wykryć sygnał fluorescencyjny. Nie należy jednak przesadnie przejmować siły, aby uniknąć przechwycenia fałszywego sygnału z autofluorescencji z komórek roślinnych.