JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:37 min • September 26th, 2025
Zacznij od dwóch szczepów bakteryjnych, referencyjnego i konkurenta, z których każdy wyraża odrębny marker fluorescencyjny do identyfikacji szczepu.
Wymieszaj szczepy w równych proporcjach i umieść mieszaninę na talerzu agarowym.
Inkubuj płytkę, aby umożliwić szczepom wzrost i interakcję.
Konkurent konkuruje z odkształceniem odniesienia dzięki mechanizmom zależnym od kontaktu lub niezależnym od kontaktu.
W konkurencji zależnej od kontaktu, zawodnik wykorzystuje wyspecjalizowane systemy wydzielania do dostarczania toksyn bezpośrednio do szczepu referencyjnego.
W konkurencji niezależnej od kontaktu zawodnik uwalnia toksyny, które dyfundują do otaczającego podłoża i dostają się do szczepu referencyjnego.
Toksyny te zakłócają podstawowe procesy w szczepie referencyjnym, w tym syntezę ściany komórkowej, replikację DNA i syntezę białek, prowadząc do zatrzymania wzrostu, śmierci komórki i zmniejszonej ekspresji fluorescencji.
Po inkubacji zbadaj płytkę pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Zmniejszona fluorescencja w szczepie referencyjnym, w porównaniu z jaśniejszą fluorescencją konkurenta, wskazuje na interakcje konkurencyjne.
Aby wymieszać szczep referencyjny i szczep konkurencji w stosunku jeden do jednego, dodaj 100 mikrolitrów każdego szczepu znormalizowanego do OD 1,0 do oznakowanej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej i wiruj przez jedną do dwóch sekund. Jako kontrolę, wymieszaj szczep referencyjny z różnie oznaczoną wersją samego siebie, a także wirem.
Bardzo ważne jest, aby osiągnąć prawidłowy współczynnik początkowy, ponieważ może to znacznie zmienić wynik eksperymentu. Aby zapewnić sukces, ten krok może wymagać optymalizacji dla danego gatunku bakterii. Po powtórzeniu tego kroku dla każdej kontrpróby biologicznej powinny istnieć cztery kontrpróby biologiczne ze szczepami referencyjnymi znakowanymi różnicowo jako kontrolami oraz cztery kontrpróby biologiczne ze szczepami referencyjnymi i konkurencyjnymi znakowanymi różnicowo.
Aby uzyskać plamki hodowlane, które zostaną użyte do mikroskopii fluorescencyjnej po inkubacji, dodaj 10 mikrolitrów każdej mieszaniny kontrolnej i doświadczalnej na płytkę Petriego zawierającą agar LBS. Po całkowitym wyschnięciu plam na ławce inkubuj płytki w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez 24 godziny.