Miejscowe dostarczanie bakterii do światła jelita larwy danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji

Weź naczynie zawierające znieczuloną larwę danio pręgowanego.

Nanieś kroplę niskotopliwej agarozy na larwę i delikatnie ustaw ją na boki, aby umożliwić dostęp do jelita podczas wstrzykiwania.

Teraz krótko ostudź agarozę, aby ją zestalić, unieruchamiając w ten sposób larwę.

Dodaj pożywkę zawierającą środek znieczulający, aby utrzymać larwę w znieczuleniu.

Następnie należy pobrać zawiesinę znakowanej fluorescencyjnie bakterii Clostridioides difficile, bakterii chorobotwórczej, i dodać barwnik znacznikowy, aby ułatwić monitorowanie wstrzyknięcia.

Załadować tę mieszaninę do igły do mikroiniekcji i zamontować igłę na mikromanipulatorze.

Pod mikroskopem stereoskopowym ustawić igłę pod kątem skierowanym w stronę jelita larwalnego.

Następnie delikatnie wprowadzić końcówkę igły do światła jelita.

Wstrzyknij bakterie bezpośrednio do światła i potwierdź pomyślne dostarczenie za pomocą barwnika znacznikowego. Następnie wycofać igłę.

Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej potwierdź lokalizację Clostridioides difficile w jelicie larwalnym.

Najpierw umieść kroplę 0,8% niskotopliwej agarozy na larwach danio pręgowanego na szalce Petriego, aby przykryć. Delikatnie ustaw larwy w pozycji bocznej. Umieść szalkę Petriego na lodzie na 30 do 60 sekund, aby niskotopliwa agaroza zastygła.

Dodaj 30% pożywki Danieau zawierającej od 0,02% do 0,04% tricainy, aby pokryć agarozę. Aby przygotować roztwór do wstrzykiwań, dodać jeden mikrolitr 0,5% czerwieni fenolowej w roztworze PBS do dziewięciu mikrolitrów barwionego barwnikiem inokulum Clostridioides difficile . Załadować skalibrowaną igłę do mikroiniekcji roztworem do wstrzykiwań za pomocą mikroładowarki.

Zamontuj załadowaną igłę w mikromanipulatorze i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym. Ustawić ciśnienie wtrysku w zakresie od 600 do 900 hektopaskalów. Ustaw czas wstrzykiwania na 0,1 do 0,3 sekundy, aby uzyskać 0,5 do 1,0 nanolitrów.

Ustaw igłę w mikromanipulatorze pod kątem około 45 stopni, skierowaną w stronę osadzonych larw. Umieść końcówkę igły nad przewodem pokarmowym, w pobliżu porów moczowo-płciowych. Przebij przez agarozę, a następnie mięsień końcówką igły.

Następnie włóż go do światła jelita i wstrzyknij od 0,5 do 1,0 nanolitrów Clostridioides difficile. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego do monitorowania wstrzykniętych larw i użyj elastycznej końcówki Microloadera, aby pobrać prawidłowo wstrzyknięte larwy do obrazowania konfokalnego.