$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Zacznij od próbki wody, która zawiera bakterie przenoszone przez wodę i przefiltruj ją, aby usunąć zanieczyszczenia.
Przenieś rozcieńczony filtrat na płytki agarowe o niskiej zawartości składników odżywczych, z których każda jest uzupełniona określonym antybiotykiem. Rozprowadzić filtrat i inkubować.
Bakterie przenoszące specyficzny gen oporności na antybiotyki rozwijają się na odpowiednich płytkach antybiotykowych i tworzą kolonie.
Policz kolonie, aby określić jednostki tworzące kolonie (CFU), reprezentujące liczbę bakterii opornych na antybiotyki.
Wybierz pojedynczą kolonię z każdej płytki i zawieś ją w sterylnej wodzie destylowanej.
Podgrzej zawiesinę, aby zlizować komórki i uwolnić zawartość wewnątrzkomórkową, w tym DNA bakterii, które zawiera gen oporności na antybiotyki.
Odwirować probówki, aby oddzielić zanieczyszczenia i zebrać supernatant zawierający DNA.
Dodaj odczynniki do amplifikacji do wyekstrahowanego DNA.
Umieść probówki w termocyklerze i uruchom program, aby amplifikować określony region bakteryjnego DNA.
Amplifikowane DNA jest gotowe do analizy sekwencji w celu identyfikacji genu oporności na antybiotyki.
Próbkę wody należy przetwarzać w sposób aseptyczny, filtrując ją przez sterylną ściereczkę muślinową w celu usunięcia wszelkich cząstek stałych. Następnie przefiltrowaną próbkę wody należy seryjnie rozcieńczyć do dalszej analizy. Aby określić liczbę bakterii opornych na antybiotyki, dodaj antybiotyki oddzielnie do probówek zawierających 20 mililitrów sterylnego stopionego agaru R2A zmodyfikowanego w przybliżeniu w temperaturze 40 stopni Celsjusza.
Zamieszać do równomiernego wymieszania i wylać na sterylne płytki Petriego, zanim agar zastygnie. Rozprowadź 100 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej na odpowiednich płytkach zmodyfikowanych agarem zawierających antybiotyk R2A. Inkubuj płytki w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin, a następnie określ liczbę bakterii.
Aby przygotować matrycę DNA z izolatów do PCR, za pomocą sterylnej wykałaczki należy pobrać pojedynczą izolowaną czystą kolonię izolatu rosnącą na płytce Petriego. Zawiesić kolonię bakteryjną w 100 mikrolitrach sterylnej podwójnie destylowanej wody w probówce z mikrowirówką i gotować we wrzącej łaźni wodnej lub suchej kąpieli przez 10 minut w temperaturze 100 stopni Celsjusza. Odwirować zawiesinę o stężeniu 10 000 g przez dwie minuty, aby osad został osadzony i przenieść supernatant do świeżej sterylnej probówki do mikrowirówki, aby użyć jej jako surowej matrycy DNA.
Aby amplifikować region V3 genu 16S rRNA metodą PCR, należy przygotować 40 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej w probówce do PCR. Umieść probówkę w bloku termicznym i uruchom odpowiedni program w termocyklerze PCR.