JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:28 min • September 26th, 2025
Weź zbiornik zawierający sterylną pożywkę wzrostową o kwaśnym pH.
Przenieś siatkę siatkową z sadzonkami roślin do zbiornika.
Uszczelnij pokrywką i porowatą taśmą, aby zachować sterylność, umożliwiając jednocześnie wymianę gazową.
Inkubować z potrząsaniem w celu napowietrzenia podłoża.
Sprawdź podłoże, aby sprawdzić, czy nie ma zmętnienia, co wskazuje na brak zanieczyszczenia bakteryjnego.
Umieść próbkę na płytce hodowlanej i inkubuj ją, aby zaobserwować brak wzrostu bakterii, potwierdzając brak bakterii zanieczyszczających.
Zaszczepić Agrobacterium, patogenem roślinnym, i inkubować.
Cząsteczki sygnałowe pochodzące z korzeni roślin i kwaśne pH aktywują białko czujnikowe związane z błoną bakteryjną.
Aktywacja indukuje ekspresję genów, wytwarzając białka do przyczepiania się bakterii do powierzchni korzeni.
Po przyłączeniu Agrobacterium dostarcza fragment DNA, znany jako TRANSFER DNA (T-DNA), do komórek roślinnych za pośrednictwem systemu wydzielenia.
Po integracji z genomem rośliny T-DNA syntetyzuje cząsteczki sygnałowe, które zwiększają kolonizację bakterii.
W wysterylizowanym okapie przepływowym wlej 18 mililitrów autoklawowanego płynnego podłoża MS do sterylnych cylindrycznych szklanych zbiorników ze sterylnymi pokrywkami.
Następnie za pomocą sterylnych kleszczy delikatnie przenieś każdy kwadrat siatki z sadzonkami w wieku od 10 do 14 dni z szalki Petriego z półstałym podłożem do hydropoicznego cylindrycznego zbiornika. Pokazane tutaj sadzonki to lucerna. Uszczelnij pokrywy zbiorników za pomocą porowatej taśmy chirurgicznej.
Następnie uprawiaj sadzonki w temperaturze od 22 do 24 stopni Celsjusza z 16-godzinnym okresem zdjęciowym i potrząsaniem z prędkością 50 obr./min. Przed inokulacją należy dokładnie zbadać zbiornik z sadzonkami pod kątem potencjalnego zanieczyszczenia. Pożywka w niezanieczyszczonych zbiornikach powinna być klarowna i przezroczysta.
Jeśli zbiorniki są mętne z powodu zanieczyszczenia, wyrzuć je i ponumeruj resztę zbiorników. Pobrać próbkę 20 mikrolitrów pożywki hydroponicznej z każdego ponumerowanego zbiornika i umieścić ją na szalce Petriego z bulionem Luria lub agarem LB. Inkubuj naczynie w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 28 godzin.
Natychmiast zaszczepić każdy numerowany zbiornik hydroponiczny 50 mikrolitrami zawiesiny Agrobacterium tumefacians do każdego numerowanego zbiornika hydroponicznego. Współhoduj sadzonki i bakterię A. tumefacians w temperaturze od 22 do 24 stopni Celsjusza z 16-godzinnym okresem zdjęciowym i wstrząsaniem przy 50 obr./min. Zbadaj nakrapianą płytkę LB po 12 i 28 godzinach inkubacji, aby zweryfikować sterylność hydroponicznej pożywki wzrostowej.
W przypadku jakiegokolwiek zanieczyszczenia nie należy używać odpowiedniego numerowanego zbiornika zaszczepionego bakteriami do dalszych testów.