Przygotowanie sferoplastów E. coli

Weźmy kulturę E. coli .

Rozcieńczyć kulturę w świeżej pożywce i inkubować ją, aby pobudzić podział bakterii.

Następnie rozcieńczyć kulturę w pożywce zawierającej inhibitor podziału bakteryjnego i inkubować.

Bakterie nadal rosną bez podziału, tworząc wydłużone włókna.

Przenieś kulturę do świeżej probówki, a następnie odwiruj, aby osadzać włókna i usunąć supernatant.

Przemyj granulat stabilizatorem osmotycznym, aby zapobiec lizie sferoplastów. Usuń roztwór.

Dodawać kolejno bufor, lizozym, DNazę i czynnik chelatujący. Inkubować.

Czynnik chelatujący destabilizuje zewnętrzną błonę filamentu.

Lizozym degraduje odsłoniętą warstwę peptydoglikanu, powodując, że włókna tracą kształt i tworzą kuliste struktury zwane sferoplastami.

Dodatkowo DNaza degraduje zanieczyszczające DNA uwalniane z uszkodzonych włókien.

Ponownie dodaj stabilizator osmotyczny, wymieszaj i inkubuj.

Przenieść zawiesinę do probówki zawierającej bufor i wirówkę.

Usunąć nadmiar supernatantu i ponownie zawiesić sferoplasty w buforze do dalszej analizy.

Aby założyć hodowlę przez noc, użyj sterylnej końcówki mikropipety, aby przenieść pojedynczą kolonię bakterii z stałej płytki do hodowli agaru do 14-mililitrowej probówki hodowlanej, zawie