Generowanie protoplastów z bakterii Gram-dodatniej Bacillus megaterium

Weźmy posiew Bacillus megaterium, bakterii Gram-dodatniej.

Rozcieńczyć kulturę w świeżych pożywkach i inkubować ją przez wstrząsanie, aby pobudzić podział bakterii.

Przenieś kulturę do probówki i odwiruj, aby otulić bakterie.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywkach zawierających stabilizatory osmotyczne, aby zapobiec lizie protoplastów.

Przenieść zawieszony roztwór do kolby, dodać lizozym i inkubować, wstrząsając.

Podczas inkubacji lizozym degraduje grubą ścianę komórkową peptydoglikanu bakterii.

W miarę degradacji ściany komórkowej bakterie zmieniają się z formy pręcika w kuliste ciała ograniczone tylko błoną plazmatyczną, tworząc protoplasty.

Wizualizuj zawiesinę pod mikroskopem.

Bakterie o okrągłym kształcie potwierdzają tworzenie się protoplastów, podczas gdy spuchnięte bakterie w kształcie pręcików wskazują na niepełne trawienie.

Przenieś roztwór do probówki i odwiruj, aby osadzać protoplasty.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić protoplasty w świeżych pożywkach zawierających stabilizatory osmotyczne do dalszej analizy.

Aby przygotować protoplasty Gram-dodatniego B. megaterium , rozcieńczyć nocną kulturę bakteryjną w stosunku jeden do 1000 w 100 mililitrach trzyprocentowego TSB w kolbie o pojemności 250 mililitrów przez 4,5 godziny inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem. Gdy płynna kultura osiągnie gęstość optyczną od 0,9 do 1,0 przy 600 nanometrach, podziel bakterie na dwie 50-mililitrowe stożkowe probówki w celu ich odwirowania i użyj pipety syrologicznej do zasysania supernatantów. Ponownie zawiesić granulki w 2,5 mililitra pożywki protoplastowej na probówkę i wciągnąć zawiesinę do pojedynczej stożkowej probówki do hodowli w kolbie o pojemności 125 mililitrów.

Dodaj jeden mililitr pięciu miligramów na mililitr lizozymu do kultury na godzinę inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wstrząsaniem. Monitorowanie wzrostu protoplastu pod mikroskopem świetlnym i odnotowywanie wszelkich nieprawidłowości, takich jak bakterie, które pojawiają się jako spuchnięte pręciki zamiast kulek. Pod koniec inkubacji przenieść zawiesinę do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach pożywki protoplastowej.

Protoplast można następnie przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do tygodnia lub do momentu, gdy przejdzie przez trzy cykle zamrażania i rozmrażania.