JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:35 min. • September 26th, 2025
Rozpocznij od szklanego szkiełka z komorą pokrytego podpartą membraną złożoną z fosfolipidów, w tym fosfolipidów biotynylowanych.
Inkubować z neutrawidyną, która wiąże się z biotyną na dwuwarstwie. Umyć w celu usunięcia nadmiaru neutrawidyny.
Wprowadź pożywkę zawierającą gigantyczne pęcherzyki lub GV. Każdy GV to kulisty dwuwarstwowy pęcherzyk lipidowy o rozmiarach mikronów, który otacza pojedynczą komórkę bakteryjną, służąc jako model do badania zachowania poszczególnych komórek w ograniczonym środowisku.
Neutrawidyna wiąże się z biotynylowanymi lipidami GV, mocując pęcherzyki do podpartej błony w celu stabilnej, długotrwałej obserwacji w warunkach statycznych.
Uszczelnij komorę, aby utrzymać nawodnienie i zminimalizować zanieczyszczenie.
Umieść szkiełko na stoliku mikroskopowym wyposażonym w platformę grzewczą, aby symulować warunki fizjologiczne i obserwować pod mikroskopem.
Składniki odżywcze z pożywki dyfundują do GV, aby z czasem wspomóc rozwój bakterii.
Taka konfiguracja umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wzrostu bakterii jednokomórkowych w ograniczonych mikrośrodowiskach pęcherzykowych.
Aby unieruchomić gigantyczne pęcherzyki na dwuwarstwowej membranie podtrzymującej, wprowadź 10 mikrolitrów neutrawaryny w zewnętrznym wodnym roztworze pęcherzyków olbrzymich do otworu na 15-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji delikatnie przemyj otwór dwa razy 20 mikrolitrami pożywki LB, uzupełnionej 200 milimolową glukozą i dodaj całą objętość roztworu pęcherzyków olbrzymich do otworu w komorze. Następnie uszczelnij otwór szklaną pokrywą o wymiarach 18 na 18 milimetrów. Aby monitorować rozwój bakterii w gigantycznych pęcherzykach, wybierz obiektyw 40X w odwróconym mikroskopie i umieść komorę w systemie podgrzewania mikroskopu.
Następnie inkubuj gigantyczne pęcherzyki zawierające komórki bakteryjne w komorze w warunkach statycznych przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, rejestrując i rejestrując obrazy wzrostu komórek bakteryjnych co 30 minut, za pomocą naukowej komplementarnej kamery półprzewodnikowej z tlenku metalu.