JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 4:20 min • September 26th, 2025
Zacznij od płytki wielodołkowej zawierającej pożywkę wzrostową wstępnie zaszczepioną bakteriami wytwarzającymi celulozę.
W studzience poddanej działaniu pożywki uzupełnia się kwasem 2-chloroetylofosfonowym ().
Uszczelnij płytkę, aby zapobiec wymianie gazowej i inkubować.
Podczas inkubacji hydrolizuje i uwalnia etylen, cząsteczkę gazową.
Etylen aktywuje bakteryjną syntazę celulozy, która wykorzystuje cytozolową glukozę UDP do syntezy celulozy.
Z biegiem czasu bakterie wytłaczają celulozę przez błonę.
Sprzyja to samoorganizacji bakterii na granicy faz powietrze-ciecz, tworząc unoszący się biofilm lub błonkę na bazie celulozy.
Po inkubacji przenieść błonki na świeżą płytkę wielodołkową. Dodaj roztwór alkaliczny i inkubuj w wyższej temperaturze, aby zlizować komórki.
Usuń roztwór alkaliczny. Wielokrotnie myć mieszaniem, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe, zachowując celulozę.
Wysuszyć i zważyć błonki. Wyższa sucha masa w próbkach poddanych działaniu w porównaniu z próbkami kontrolnymi wskazuje na zwiększoną produkcję celulozy bakteryjnej w odpowiedzi na etylen.
Test błonki jest standardowym narzędziem analitycznym do produkcji celulozy bakteryjnej. PH i analiza morfologiczna są szczegółowo opisane w protokole tekstowym. W ramach przygotowań należy trzykrotnie pobrać komórki z kultur starterowych i oznaczyć ilościowo komórki za pomocą komory liczącej Petroffa-Hausera.
Następnie należy przygotować cztery mieszanki główne pożywki o różnych stężeniach. Dla każdej mieszanki wzorcowej należy podać 60 mililitrów pożywki o pH 7 SH i dodać 120 mikrolitrów 0, 5, 50 lub 500 milimolowego roztworu podstawowego, aby uzyskać końcowe stężenia 0, 0,01, 0,1 lub 1,0 milimola. Wymieszać te media, obracając kolbami.
Do każdego z trzech pożywek potrzebny jest jeden zestaw pożywki, a czwarty zestaw jest potrzebny, aby działał jako sterylna kontrola. Tak więc podziel każdy 60-mililitrowy preparat na cztery 14-mililitrowe podwielokrotności. Następnie wstępnie schłodzić 14-mililitrowe porcje przed zaszczepieniem odpowiednimi kulturami starterowymi do końcowego stężenia 100 000 komórek na mililitr.
Trzymaj wszystkie zaszczepione probówki na lodzie, aby zapobiec produkcji celulozy. Użyj pozostałych 14 mililitrowych porcji do sterylnych studzienek kontrolnych. Teraz, z każdej 14-mililitrowej mieszanki wzorcowej, załaduj dwie mililitrowe podwielokrotności do sześciu dołków sterylnej 24-dołkowej płytki, co daje w sumie cztery załadowane płytki na analizowaną kulturę starterową.
Ostrożnie uszczelnij płytki folią parafinową i inkubuj je statycznie przez siedem dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Aby zebrać błonkę z talerza, naciśnij jedną stronę błonki, aby podnieść przeciwległą krawędź i podnieś ją kleszczami.
Następnie indywidualnie przenieś błonki do dołków sześciodołkowej płytki. Potraktuj je 12 mililitrami 0,1 normalnego wodorotlenku sodu w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby zlizować komórki. Następnie usuń wodorotlenek sodu i zneutralizuj poddane działaniu błonek poprzez dokładne przemycie ich 12 mililitrami ultra czystej wody przez 24 godziny z mieszaniem w sześciodołkowej płytce.
Podczas tej inkubacji zmieniaj wodę co sześć godzin. Po zakończeniu inkubacji błonki powinny być białe. Następnie umieść błonki na matach silikonowych i susz je w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 48 godzin, aby przygotować je do pomiaru suchej masy.
Niniejsze badanie analizuje produkcję celulozy bakteryjnej z wykorzystaniem bakterii produkujących celulozę w kontrolowanym środowisku. Dodatek kwasu 2-chloroetylophosphonowego (CEPA) zwiększa syntezę celulozy poprzez aktywację etylenem.
Ilościowa ocena odpowiedzi bakterii na etylen za pomocą CEPA umożliwia precyzyjne badanie szlaków biosyntezy celulozy, wspierając wczesną walidację celów w biotechnologii mikrobiologicznej. Podejście to zapewnia pewność prognostyczną w optymalizacji mikrobiologicznych systemów produkcyjnych oraz dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji uwzględniających ryzyko w procesach rozwoju bioprocesów.
Metoda ta integruje się z continuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając ilościową weryfikację hipotez, standaryzację testów oraz powtarzalną analitykę w procesie produkcji celulozy mikrobiologicznej.
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026