Amplifikacja plazmidu samobójczego w gospodarzu bakteryjnym

Zacznij od pastylki bakteryjnej. Bakterie zawierają gen kodujący białko inicjujące, ale nie mają genu oporności na antybiotyki.

Ponownie zawiesić osad w schłodzonej wodzie, aby zminimalizować degradację komórkową.

Weźmy plazmid przenoszący gen oporności na antybiotyki i gen docelowy. Ten plazmid nazywany jest plazmidem samobójczym, ponieważ nie może się replikować bez białka inicjującego.

Dodaj plazmid do zawiesiny bakteryjnej.

Przenieść zawiesinę do schłodzonej kuwety.

Zainicjuj elektroporację, przykładając impuls o wysokim napięciu, który przejściowo rozrywa błonę bakteryjną, umożliwiając wejście plazmidu.

Dodaj pożywkę regeneracyjną i przenieś mieszaninę do probówki hodowlanej.

Inkubować z potrząsaniem.

Weź płytkę agarową zawierającą antybiotyk i ułóż na niej posiew.

Białko inicjujące bakterię wiąże się z początkiem replikacji, umożliwiając plazmidowi replikację i ekspresję białka oporności na antybiotyki.

Dzięki temu bakterie z plazmidem mogą przetrwać i rosnąć, ułatwiając amplifikację plazmidu.

Osadzaj kulturę bakterii przez odwirowanie w temperaturze 5 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Zawieś granulat w schłodzonej wodzie destylowanej i powtórz proces czyszczenia jeszcze dwa razy.

Przenieś zawiesinę bakterii do probówek do mikrofug i powtórz wirowanie w temperaturze 14 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Po ponownym zawieszeniu osadu w schłodzonej wodzie dodać około 3,5 mikrolitra mieszaniny ligacji i inkubować na lodzie przez pięć minut. Przenieść zawartość do schłodzonej kuwety elektroporacyjnej o odstępie dwóch milimetrów.

Po elektroporacji dodać pożywkę SOC i przenieść zawartość do probówki hodowlanej. Inkubować przez godzinę w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Umieść przekształcone komórki na płytkach agarowych LB uzupełnionych chloramfenikolem.