JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:13 min. • September 26th, 2025
Weźmy posiew S. aureus wrażliwy na antybiotyk chloramfenikol.
Odwirować w celu osadzenia bakterii i usunięcia supernatantu.
Przenieść osad do probówki zawierającej pożywkę ograniczającą składniki odżywcze i inkubować. Stres związany ze składnikami odżywczymi zwiększa kompetencje – zdolność bakterii do internalizacji obcego DNA.
Ponownie odwirować i usunąć supernatant. Zawiesić osad w świeżych pożywkach ograniczających składniki odżywcze.
Następnie dodaj DNA wyekstrahowane ze szczepu S. aureus niosącego gen oporności na chloramfenikol. Inkubować.
Maszyneria wychwytu DNA przetwarza DNA w pojedynczą nić i przenosi je do cytoplazmy, gdzie integruje się z chromosomem bakteryjnym.
Odwirować i usunąć supernatant. Zawiesić osad w pożywce bogatej w składniki odżywcze.
Przenieść zawiesinę do stopionego, bogatego w składniki odżywcze agaru zawierającego chloramfenikol.
Wlej mieszaninę do naczynia i inkubuj.
Wzrost kolonii opornych na chloramfenikol wskazuje na pomyślne wychwytywanie DNA.
Hoduj komórkę biorczą przez noc w pięciu mililitrach TSB w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem. Następnego ranka przenieś 0,5 mililitra nocnej kultury do 1,5 mililitrowej probówki.
Wytrącić komórki przez odwirowanie. Następnie zawieś komórki z 10 mililitrami pożywki CS2 w 50-mililitrowej probówce. Następnie hoduj bakterie w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 180 obrotów na minutę przez osiem godzin, aż do późnej fazy wykładniczej.
Zbierz komórki przez odwirowanie. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach świeżej pożywki CS2. Dodać 10 mikrogramów oczyszczonego plazmidu lub genomowego DNA do zawiesiny komórki.
Potrząśnij kulturą z prędkością 180 obrotów na minutę. Następnie zbierz komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach pożywki BHI.
Wymieszaj zawiesinę komórkową z 90 mililitrami stopionego suplementu agarowego BHI Z 32 miligramami na litr chloramfenikolu i pięcioma mikrogramami na litr tetracykliny w eksperymencie kontrolnym. Wlej mieszaninę do 90-milimetrowych szalek Petriego, szybko ostudź i pozwól agarowi zastygnąć. Replikuj kolonie za pomocą wykałaczek na płytki zawierające odpowiednie antybiotyki, aby potwierdzić ich charakterystykę oporności.