JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:35 min. • September 26th, 2025
Weź płytkę wielodołkową zawierającą podłoże agarowe wstępnie nakrapiane bakteriami RNAi, z lub bez wkładki specyficznej dla genu ukierunkowanej na gen C. elegans .
Wysiewanie zsynchronizowało robaki w stadium L1 ze studzienkami i inkubowało je, aby umożliwić odżywianie się bakteriami RNAi.
Wstawka wytwarza interferujące RNA, które celuje w określone geny robaków, generując fenotyp nokautu specyficzny dla genu.
Dodaj bufor do studzienek i delikatnie ponownie zawieś robaki.
Przenieś zawiesinę na płytę głębinową i pozwól robakom osiąść grawitacyjnie.
Usunąć supernatant, zachowując pewien bufor.
Umyj robaki buforem, a następnie wyrzuć supernatant, pozostawiając niewielką ilość buforu.
Następnie weź wielodołkową płytkę testową zawierającą bakterie chorobotwórcze.
Dozuj określoną liczbę robaków kontrolnych i knockdown do odpowiednich studzienek, aby umożliwić interakcje gospodarz-patogen. Bakterie chorobotwórcze wydzielają związki, które indukują śmiertelność robaków.
Porównaj śmiertelność robaków, aby ocenić wpływ specyficznego dla genu knockdownu na przeżycie robaków.
Dodaj jeden mililitr S Basal na dołek 24-dołkowej płytki zawierającej 300 robaków na studzienkę. Delikatnie porusz robaki, potrząsając płytką, a następnie przenieś robaki na pustą, sterylną płytkę z 24 głębokimi dołkami.
Pozwól robakom osiąść grawitacyjnie, około pięciu minut. Odessać supernatant, pozostawiając około jednego mililitra na studzienkę, a następnie dodać 7 mililitrów S Basal do każdej studzienki. Powtórz pranie jeszcze dwa razy, a następnie po ostatnim praniu odessaj wszystko, oprócz około 400 mikrolitrów supernatantu.
Po pipetowaniu bakterii do płytek 384-dołkowych, aby uniknąć głodu, korzystając z funkcji ponownego pobierania próbek sortownika robaków, posortuj 22 robaki do każdej studzienki płytki 384-dołkowej. Na koniec, po sortowaniu, dodaj małe cząsteczki lub inne materiały specyficzne dla eksperymentu.