Ocena śmiertelności larw C. elegans wywołanej przez bakterie chorobotwórcze

Zacznij od chorobotwórczej bakterii wyhodowanej na agare.

Zeskrob bakterie, zawieś je w buforze i dodaj pożywkę, aby utrzymać żywotność bakterii.

Dozować zawiesinę do mikropłytki.

Następnie weź oddzielne szczepy larw C. elegans , o zwiększonej podatności na patogeny lub o zwiększonej odporności, i pozwól im się osiedlić.

Usunąć supernatant, ponownie zawiesić larwy w świeżym podłożu i przenieść je do mikropłytki zawierającej bakterie.

Uszczelnić mikropłytkę membraną przepuszczającą gaz i rozpocząć inkubację. Bakterie wydzielają toksyczne metabolity, które aktywują szlaki stresu i prowadzą do śmierci komórki.

Umyj studzienki, aby wyeliminować bakterie, dodaj nieprzepuszczalny dla komórek barwnik fluorescencyjny i inkubuj.

Barwnik wnika tylko do martwych komórek larwalnych z przerwanymi błonami i wiąże się z ich kwasami nukleinowymi.

Umyj w celu usunięcia nadmiaru barwnika i zobrazuj fluorescencyjnie zabarwione robaki, aby ocenić śmiertelność wrażliwych i opornych szczepów.

Aby przeprowadzić test zabijania cieczy, użyj skrobaka do komórek, aby usunąć P. aeruginosa z płytki SK i ponownie zawiesić bakterie w około 5 mililitrach S Basal.

Za pomocą spektrofotometru zmierz OD 600 zawiesiny bakteryjnej. Przygotować 24 mililitry rozcieńczonego bulionu P. aeruginosa w S Basal przy OD 600 równym 0,09, następnie dodać 21 mililitrów płynnego podłoża SK i za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 45 mikrolitrów bakterii i pożywki do każdej studzienki płytki 384-dołkowej. Umyj robaki od ich źródła do 50-mililitrowej stożkowej rurki i pozwól im osiąść pod wpływem siły grawitacji.

Odessać supernatant do 5 mililitrów, a następnie użyć łącznie 50 mililitrów S Basal do ponownego zawieszenia robaków i powtórzyć pranie jeszcze dwa razy. Za pomocą sortownika robaków posortuj około 22 robaki do każdej studzienki płytki 384-dołkowej, zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie użyj folii przepuszczającej gaz, aby uszczelnić płytkę i inkubować ją w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin. W żądanym czasie użyj myjki do mikropłytek i S Basal, aby umyć płytkę 384-dołkową w sumie 5 razy.

Jednym z najłatwiejszych błędów do popełnienia jest zassanie płytki 384-dołkowej, zanim robaki całkowicie się usiądą. Potrzeba praktyki, aby móc dokładnie zobaczyć, czy robaki całkowicie się ustabilizowały. Po ostatnim praniu odessać supernatant do 20 mikrolitrów.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów 0,98 mikromolowego barwnika kwasu nukleinowego na studzienkę, aby uzyskać końcowe stężenie 0,7 mikromola. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 12 do 16 godzin. Po pożądanym okresie inkubacji należy użyć myjki do mikropłytek, aby umyć płytki co najmniej trzy razy.

Do akwizycji danych użyj spektrofotometru lub mikroskopu automatycznego, aby zobrazować zarówno światło przechodzące, jak i fluorescencję.