Name: Znakowanie kolczastych końców F-aktyny za pomocą rodaminy-aktyny w przepuszczalnych stożkach wzrostu neuronów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj metodę znakowania kolczastych końców F-aktyny rodaminy-aktyną w przepuszczalnych stożkach wzrostu neuronów. Technika ta umożliwia wizualizację dynamiki aktyny pod wpływem sygnałów naprowadzających.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr. Jamesowi Bamburgowi oraz członkom jego laboratorium za współpracę przy tych badaniach. Praca ta była finansowana z grantów NIH HD19950, EY07133 oraz z grantów przyznanych przez Minnesota Medical Foundation.

W celu znakowania aktyny rodamyną, neurony hoduje się na szkiełkach podstawkowych umieszczonych na dnie plastikowych szalek o średnicy 35 mm lub na szkiełkach przyklejonych do szalek typu „video”.
1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych lub naczyń do obrazowania wideo
<ol>
<li>Wiele typów neuronów wykazuje słabą adhezję do podłoży in vitro. Szkiełka podstawowe, niezbędne do tej procedury, mogą nie zapewniać wystarczającego przylegania neuronów do podłoża, jeśli nie zostaną odpowiednio oczyszczone i przygotowane. Szczegółowa procedura mycia szkiełek kwasami i ich czyszczenia została opisana w książce Culturing Nerve Cells pod redakcją Bankera i Goslina. Alternatywnie, w krokach 1.7 i 1.8 poniżej opisano powlekanie szkiełek nitrocelulozą, która silnie wiąże cząsteczki podłoża.</li>
<li>Szkiełka podstawowe (np. kwadratowe 18 mm lub okrągłe 24 mm) płucze się w dH2O i wypala w suchej cieple (≥225°C) tak długo, jak to możliwe (minimum kilka dni, do trzech miesięcy lub dłużej), aby usunąć ślady związków organicznych. Należy przejść do kroku 1.6 lub, w przypadku przygotowania naczyń do wideomikroskopii, do kroku 1.3.</li>
<li>Aby stworzyć cienkie, przezroczyste szklane podłoże do wideomikroskopii o wysokiej rozdzielczości, w dnach plastikowych szalek Petriego lub naczyń do hodowli tkanek o średnicy 35 lub 50 mm wierci się okrągłe otwory o odpowiedniej średnicy za pomocą elektrycznego wycinaka do korków (lub podobnego instrumentu). Wiercenie wykonuje się powoli, z lekkim naciskiem, aby uniknąć pęknięcia plastiku. Krawędzie wywierconego otworu skrobie się nożyczkami, aby uzyskać gładką powierzchnię po obu stronach.</li>
<li>Szkiełka podstawowe oczyszcza się do zastosowań w hodowlach tkankowych zgodnie z opisem w punktach 1.1 lub 1.2. Szkiełka przykleja się nad otworami, używając nietoksycznego silikonowego kleju akwariowego (dla szkiełek 18x18 mm stosuje się wiertło o średnicy 12 mm). Klej utwardza się przez 24 godziny.</li>
<li>(Kolejne kroki wykonuje się w warunkach sterylnych) Naczynia do wideomikroskopii płucze się 3 razy sterylną dH2O i pozostawia do wyschnięcia na powietrzu.</li>
<li>Szkiełka powleka się cząsteczkami podłoża dla hodowli neuronalnych. Najpierw powierzchnię szkiełka pokrywa się (250 μL dla szkiełka 18x18) roztworem 100 μg/ mL poli-D-lizyny w PBS przez 4-8 h (lub przez noc) w inkubatorze z wilgotnością przy 38° C. Następnie szkiełka płucze się 3 razy sterylną dH2O, aby usunąć niewiązaną poli-D-lizynę, i pozostawia do wyschnięcia na powietrzu. Wiele typów neuronów hoduje się na szkiełkach powlekanych samą poli-D-lizyną, jeśli do pożywki hodowlanej dodaje się białka surowicy. Jednak wyniki bardziej zbliżone do warunków in vivo uzyskuje się przy użyciu naturalnych cząsteczek podłoża. Roztwory tych cząsteczek, takich jak laminina, fibronektyna lub L1 CAM (1-20 μg/ mL w PBS), można nanosić bezpośrednio na szkiełka powlekane poli-D-lizyną przez 4-8 h lub przez noc, jednak w naszym laboratorium rutynowo powlekamy przygotowane szkiełka cienką warstwą nitrocelulozy przed naniesieniem cząsteczek adhezyjnych, aby zwiększyć wiązanie białka z podłożem.</li>
<li>Należy przygotować 1% roztwór nitrocelulozy, rozpuszczając 5 g nitrocelulozy w 5 mL 100% octanu amylu. Nanieść 10 μL tego roztworu na szkiełko i delikatnie rozprowadzić po powierzchni. Suszyć na powietrzu przez 10 minut.</li>
<li>Nanieść 250 μL roztworu 25 μg/ mL lamininy lub 4 μg/ mL L1 CAM w PBS i rozprowadzić po powierzchni nitrocelulozy. Inkubować przez 4 godziny (lub przez noc) w inkubatorze z wilgotnością przy 38° C, odessać podłoże i natychmiast dodać pożywkę hodowlaną, aby podłoże nie wyschło.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kultur neuronalnych
<ol>
<li>Z jaj wyjmuje się zarodki kurczęce z 7. dnia rozwoju embrionalnego i umieszcza w szalkach Petriego o średnicy 100 mm zawierających pożywkę hodowlaną z 10% surowicą, a następnie przy użyciu stereomikroskopu przeprowadza się sekcję w celu usunięcia organów wewnętrznych z klatki piersiowej i jamy brzusznej.</li>
<li>Zarodki płucze się pożywką, przenosi do szalki o średnicy 60 mm z płynną pożywką i poddaje dalszej sekcji w celu wycięcia i przygotowania eksplantatów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) lub tkanek siatkówki neuronalnej. Szczegółowy opis sekcji znajduje się w publikacji Methods in Cell Biology, tom 71, Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist, red. Hollenbeck i Bamburg. Eksplantaty DRG stanowią 1/2 całego zwoju, a eksplantaty siatkówki neuronalnej mają średnicę 1 mm lub mniejszą.</li>
<li>Po oczyszczeniu eksplantatów z tkanek zbędnych, poszczególne eksplantaty przenosi się pęsetą zegarmistrzowską na szkiełka nakrywkowe, które znajdują się już w naczyniach hodowlanych z pożywką. Pod mikroskopem sekcyjnym eksplantat jest delikatnie dociskany pęsetą do środka szkiełka, aby zapobiec jego przesunięciu podczas transportu do inkubatora. Eksplantaty hoduje się w pożywce F12 z dodatkiem B27, buforowanej 10 mM HEPES do pH 7.4, i pozostawia na noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 38° C. Do pożywki hodowlanej można, w razie potrzeby, dodać czynniki wzrostu. Do kultur DRG z starszych zarodków często dodaje się neurotrofiny, choć neurony DRG z E7 będą wydłużać aksony z eksplantatów bez dodatku neurotrofin. Eksplantaty siatkówki neuronalnej wydłużają aksony w tej pożywce bez konieczności dodawania czynników wzrostu.</li>
<li>Kultury inkubuje się przez co najmniej 18 godzin, aby umożliwić wystarczający wzrost aksonów przed rozpoczęciem poniższej procedury.</li>
</ol>
3. Przygotowanie buforu do permeabilizacji z rodamyną i aktyną
<ol>
<li>Roztwór zapasowy buforu permeabilizującego zawierający 138 mM KCl, 10 mM PIPES, 3 mM EGTA, 4mM MgCl2 oraz 1% BSA (pH = 6.9) można przechowywać do 2 tygodni w temperaturze 4°C11. Bezpośrednio przed użyciem dodaje się następujące składniki do uzyskania stężenia końcowego: 0,025% saponiny, 0,1 mM ATP oraz 100 nM faloidyny Alexa-fluor 350.</li>
<li>Bezpośrednio przed użyciem przygotowuje się również osobny, świeży roztwór z tymi samymi składnikami oraz 0,45μM rodaminowej aktyny pozap mięśniowej. Roztwór jest naprzemiennie mieszany w wirówce vortex i tritrowany przez 5 min w celu rozpuszczenia grudek rodaminy-aktyny, a następnie mieszany w wirówce vortex przez 1 min podczas początkowego etapu permeabilizacji, aby zapobiec polimeryzacji w probówce. Jeśli mimo to problemem pozostaje tworzenie się filamentów w probówce, roztwór można odwirować przed użyciem.</li>
</ol>
4. Permeabilizacja kultur neuronalnych i inkorporacja rodaminowej aktyny do końców barbed F-aktyny
<ol>
<li>Szalkę hodowlaną z eksplantatami zwojów korzeniowych tylnych (DRG) lub siatkówki ostrożnie wyjmuje się z inkubatora, a kolejne kroki wykonuje w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Wszelkie wymiany roztworów należy przeprowadzać ostrożnie. Końcówkę pipety należy umieścić przy krawędzi szkiełka nakrywkowe, a roztwory usuwać i dodawać powoli oraz z minimalną siłą.</li>
<li>Pożywkę hodowlaną usuwa się za pomocą pipety ostrożnie, lecz zdecydowanie, a następnie dodaje wystarczającą ilość buforu do permeabilizacji, aby pokryć komórki, na 1 min (dla szkiełka nakrywkowe 18 mm x 18 mm jest to ~60 μL). Przed dodaniem buforu do permeabilizacji kultury nie płucze się żadnymi innymi roztworami, a szkiełka nakrywkowe nie wolno dopuścić do wyschnięcia.</li>
<li>Bufor do permeabilizacji delikatnie usuwa się pipetą i zastępuje buforem do permeabilizacji zawierającym 0,45 μM rodaminy-aktyny pozwalający na inkubację przez 4 min.</li>
<li>Bufor zawierający rodaminę-aktynę delikatnie usuwa się pipetą, a neurony utrwala, dodając roztwór 4% paraformaldehydu (klasy laboratoryjnej, przygotowany w buforze fosforanowym, pH 7,3), 0,05% glutaraldehydu i 10% sacharozy. Po 5 minutach utrwalania szkiełka nakrywkowe delikatnie płucze się w PBS, a następnie montuje w medium Slowfade na 3-calowych szkiełkach przedmiotowych.</li>
<li>Alternatywną metodą wymiany roztworów jest zastosowanie komory przepływowej. Może to być komercyjnie dostępna komora przepływowa lub prosta komora wykonana poprzez umieszczenie małych kawałków plastiku (grubości ≤ 1 mm) jako dystansów w narożnikach szkiełka nakrywkowe, a następnie zamontowanie na górze drugiego szkiełka nakrywkowe o tej samej wielkości. Wymianę roztworów można przeprowadzać, umieszczając pipetę po jednej stronie komory przepływowej i odciągając roztwory za pomocą knota (bawełnianego lub chusteczki Kimwipe) po drugiej stronie.</li>
<li>Wbudowanie rodaminy-aktyny w końce typu barbed F-aktyny oraz znakowanie F-aktyny fluorescencyjną falloidyną w stożkach wzrostu wizualizuje się za pomocą optyki epifluorescencyjnej z obiektywem imersyjnym 60X, a obrazy rejestruje za pomocą chłodzonej kamery CCD. Mikroskop konfokalny może zapewnić lepszą jakość obrazowania.</li>
<li>W celu uzyskania najlepszej ilościowej oceny wbudowania rodaminy-aktyny wszystkie obrazy powinny zostać zarejestrowane podczas jednej sesji, przy zastosowaniu tych samych ustawień wzmocnienia i czasu ekspozycji czułości kamery cyfrowej dla każdego zdjęcia. Analizę znakowania należy przeprowadzić dla równoważnych obszarów każdego obrazu; można do tego wykorzystać programy Metamorph, Image J lub podobne komputerowe narzędzia do analizy obrazu.</li>
</ol>
ODMIANY TEJ PROCEDURY
5. Wariant pierwszy: Pozyskiwanie obrazów żywych komórek przed znakowaniem rodamina-aktyną
<ol>
<li>Szalki do wideomikroskopii umieszcza się na podgrzewanym stoliku mikroskopu i rejestruje obrazy żywych stożków wzrostu. Można zastosować szkiełka zakryjące w siatkę, wykonać na nich trawienia i/lub oznaczenia pisakiem, aby łatwiej zlokalizować konkretne komórki po znakowaniu, lub unieruchomić szalkę na stoliku mikroskopu na cały czas trwania procedury.</li>
<li>Permeabilizację, wbudowywanie rodaminy-aktyny oraz fiksację komórek przeprowadza się w szalkach do wideomikroskopii, na stoliku mikroskopu lub poza nim. Po fiksacji do szalek dodaje się PBS w celu natychmiastowego obrazowania. Aby zachować próbkę do późniejszego obrazowania, na szkiełko zakryjące nanosi się medium montażowe slowfade, ostrożnie nakłada na nie drugie szkiełko zakryjące o tej samej wielkości (unikając powstania pęcherzyków powietrza), a krawędzie uszczelnia bezbarwnym lakierem do paznokci.</li>
</ol>
6. Wariant drugi: immunochemia w celu wspólnego znakowania dodatkowych białek
<ol>
<li>Inkorporację rodaminy-aktyny i fiksację można przeprowadzić na neuronach hodowanych na szkiełkach podstawkowych lub w naczyniach do obrazowania wideo, zgodnie z powyższym opisem (4.2-4.4).</li>
<li>Po fiksacji i przemyciu w PBS, komórki traktuje się przez 15 min 0,1 M glicyną w PBS, a następnie ekstrahuje przez 1 h za pomocą 0,1% Triton X-100 (TX-100) w PBS z 2% surowicą kozią i 1% BSA. Szkiełka podstawkowe inkubuje się przez 1 h z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w PBS zawierającym 1% BSA. Następnie szkiełka przemywa się i inkubuje przez 1 h w 0,1% TX-100 w PBS z 2% surowicą kozią i 1% BSA, przed zastosowaniem fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych w rozcieńczeniu 1:1000 w PBS z 1% BSA przez 1 h. Po przemyciu szkiełka ponownie inkubuje się przez 30 min w 0,1% TX-100 w PBS z 2% surowicą kozią i 1% BSA, przemywa i montuje w medium zapobiegającym blaknięciu. Lokalizacja niektórych białek zostaje zaburzona przez wstępny etap permeabilizacji (4.3). Aby zachować te białka w celu ich lokalizacji za pomocą przeciwciał, do buforu do permeabilizacji można dodać 0,05% paraformaldehydu i 0,05% glutaraldehydu na 1 min (tj. przed dodaniem rodaminy-aktyny), co nie wpływa na znakowanie końców barbed przez rodaminę-aktynę.</li>
<li>Obrazy potrójnie znakowanych stożków wzrostu rejestruje się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej.</li>
</ol>
7. Wariant trzeci: Ocena wpływu sygnałów kierunkowych na wolne końce typu barbed F-aktyny
<ol>
<li>Czynnik wzrostu lub sygnał kierujący jest dodawany do naczyń hodowlanych w inkubatorze w stężeniach rzędu kilku ng/mL na kilka minut (lub odpowiedni czas traktowania) przed wyjęciem naczynia z inkubatora i rozpoczęciem procedury permeabilizacji. Pozwala to na ocenę krótkotrwałych efektów czynników wzrostu lub sygnałów kierujących na wolne końce barbed F-aktyny.</li>
<li>Naczynie do obserwacji wideo z kulturami neuronalnymi można umieścić na podgrzewanym stoliku mikroskopu, a następnie uwalniać czynniki wzrostu lub sygnały kierujące z mikropipety w formie gradientu w pobliżu stożka wzrostu przed rozpoczęciem permeabilizacji i wbudowy rhodamine-actin. Na przykład, dla neuronów DRG można uwalniać NGF, a dla komórek zwoju siatkówkowego netrynę. Pipetę można wprowadzić na okres zaledwie 1-2 minut przed rozpoczęciem procedury permeabilizacji. Pozwala to na ocenę lokalnych efektów gradientu sygnału kierującego na formowanie wolnych końców barbed F-aktyny w przedniej krawędzi stożka wzrostu (obrazowanie patrz w cytowaniu referencyjnym 10).</li>
<li>Warianty te można łączyć z znakowaniem innych komponentów neuronalnych za pomocą przeciwciał, jak opisano w punkcie 6.2 powyżej.</li>
</ol>
8. Wariant czwarty: Znakowanie wolnych końców barbed F-aktyny w neuronach po transfekcji
<ol>
<li>W celu oceny udziału białka w regulacji wolnych końców barbed F-aktyny można zastosować konstrukty konstytutywnie aktywne lub dominantno-negatywne, bądź wyciszenie ekspresji białka za pomocą RNAi (z zastosowaniem fluorescencyjnego markera identyfikacyjnego). W zależności od rodzaju białka, jego lokalizacji w stożku wzrostu oraz tego, czy jest ono połączone z tagiem fluorescencyjnym, fluorescencyjne białko wyrażone w transfekowanych komórkach może ulec utracie podczas permeabilizacji. W takim przypadku do mikroskopowej identyfikacji transfekowanej komórki przed permeabilizacją można użyć szalek do wideomikroskopii, a samą permeabilizację przeprowadzić na stole mikroskopu po zaznaczeniu pozycji transfekowanych komórek. Alternatywnie, wraz z konstruktem białka zainteresowania z GFP można ko-transfekować konstrukt GFP-aktyny. Wówczas GFP-aktyna zostanie wbudowana w F-aktynę i nie zostanie utracona podczas permeabilizacji, co umożliwi identyfikację transfekowanych komórek po zakończeniu tego procesu.</li>
<li>Tę modyfikację można połączyć z dodaniem sygnałów kierujących, zgodnie z opisem w punktach 7.1-7.3 powyżej.</li>
</ol>
9. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig1.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna; barwienie Rh-aktyną/faloidyną; wpływ NGF/cytD na strukturę komórki; wyniki nałożone." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Globalna aplikacja NGF zwiększa całkowitą ilość F-aktyny oraz liczbę końców barbowych F-aktyny na krawędzi prowadzącej stożka wzrostu. Po stymulacji stożka wzrostu z zwoju korzeniowego tylnego (DRG) czynnikiem wzrostu nerwów (NGF) przez 5 minut, dochodzi do stymulacji polimeryzacji aktyny na krawędzi prowadzącej, co objawia się jasnym pasmem znakowania rodaminą-aktyną wokół peryferii stożka wzrostu. Rycina 1 przedstawia porównanie wbudowania rodaminy-aktyny w niestymulowany stożek wzrostu DRG oraz w stożek wzrostu DRG stymulowany NGF. Zielona fluorescencja na obrazach nałożonych to znakowanie F-aktyny w stożku wzrostu faloidyną, a czerwona to znakowanie rodaminą-aktyną. Dobrą kontrolą dla znakowania końców barbowych jest dodanie 10-6 M lub więcej cytochalazyny B lub D do buforu permeabilizującego w krokach 4.2 i 4.3. Cytochalazyny blokują końce barbowe F-aktyny i hamują wiązanie rodaminy-aktyny z tymi końcami. Powinno to znacznie ograniczyć lub całkowicie wyeliminować wbudowanie rodaminy-aktyny do komórki. Paski skali, 10 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig2.jpg" alt="Mikroskopia żywych komórek, barwienie Rh-aktyną i faloidyną; obrazowanie fluorescencyjne, analiza morfologii komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Gradient NGF lokalnie zwiększa liczbę wolnych końców barbed F-aktyny. Mikropipeta uwalniająca NGF jest przybliżana do jednej strony stożka wzrostu DRG na 2 minuty, po czym następuje znakowanie wolnych końców barbed F-aktyny. Poniższe obrazy pokazują, że ekspozycja na gradient NGF lokalnie stymuluje wzrost liczby wolnych końców barbed F-aktyny w obszarze stożka wzrostu znajdującym się bliżej pipety. Obraz złożony przedstawia faloidynę w kolorze zielonym i rodaminę-aktynę w kolorze czerwonym. Pasek skali, 10 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig3.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna rozkładu aktyny i białek ERM w komórce, przedstawiająca układ cytoszkieletu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Aktywowane białka ERM gromadzą się na przedniej krawędzi stożka wzrostu. Wyznakowanie immunocytochemiczne fosfo-Ezryny/Radixyny/Moesiny (pERM) oraz wolnych końców barbowych F-aktyny. Do początkowego buforu do permeabilizacji dodano glutaraldehyd (0,05%) i paraformaldehyd (0,05%) na jedną min w celu zachowania lokalizacji ERM. Rodamina-aktyna, kolor czerwony; pERM, kolor zielony; falloidyna, kolor niebieski. Pasek skali, 10 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig4.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii konfokalnej wykazujące dystrybucję GFP-aktyny i Rh-aktyny, analiza nałożenia fluorescencji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. Stymulacja polimeryzacji aktyny wymaga aktywnych białek ERM. Rozdzielone zwoje korzeni grzbietowych (DRGs) poddano kotransfekcji GFP-aktyną oraz kontrolnym plazmidem GFP lub konstruktem dominantno-negatywnym Ezryny/Radixyny/Moezyny (DN ERM). Zastosowanie GFP-aktyny pozwala na identyfikację komórek transfektowanych po permeabilizacji. W tym przypadku NGF dodano 5 min przed znakowaniem końców typu barbed F-aktyny. Należy zwrócić uwagę, że stożek wzrostu transfektowany DN ERM wykazuje obniżony poziom końców barbed na krawędzi prowadzącej stożka wzrostu (dolny panel środkowy), co kontrastuje z pobliskim nietransfektowanym stożkiem wzrostu (panele dolne) lub z kontrolą GFP (górny panel środkowy). Aktyna rodamina, kolor czerwony; GFP-aktyna, kolor zielony. Paski skali, 10 μm.

<ol><li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+Understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li>
<li>Letourneau, P. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLetourneau%2C+P+%22Encyclopedia+of+Neuroscience%22">Encyclopedia of Neuroscience</a>. Squire, L. R. , Academic Press. Oxford. 1139-1145 (2008).</li>
<li>Kalil, K., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touch+and+go%3A+Guidance+cues+signal+to+the+growth+cone+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobio%22%5BJournal%5D)">Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton.</a> Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).</li>
<li>Dent, E. W., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+and+transport+in+growth+cone+motility+and+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance.</a> Neuron. 40, 209-227 (2003).</li>
<li>Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-binding+proteins+take+the+reins+in+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Actin-binding proteins take the reins in growth cones.</a> Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).</li>
<li>Guan, K. L., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+mediating+neuronal+responses+to+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues.</a> Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).</li>
<li>Gallo, G., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+growth+cone+actin+filaments+by+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues.</a> J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).</li>
<li>Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+filopodial+dynamics+through+actin-depolymerizing+factor%2Fcofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Sci+Inter%22%5BJournal%5D)">Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin.</a> Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).</li>
<li>Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2Fcofilin%3A+A+functional+node+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ADF/cofilin: A functional node in cell biology.</a> Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).</li>
<li>Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+ADF%2Fcofilin+mediates+attractive+growth+cone+turning+toward+nerve+growth+factor+and+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1.</a> Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).</li>
<li>Symons, M. H., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+actin+polymerization+in+live+and+permeabilized+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts.</a> J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).</li>
<li>Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+stimulates+an+increase+in+actin+nucleation+and+filament+number+at+the+leading+edge+of+the+lamellipod+in+mammary+adenocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells.</a> J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Metody przedstawione w niniejszej pracy pozwalają na rozdzielczość czasową i przestrzenną komponentów komórkowych zaangażowanych w dynamiczne przebudowy cytoszkieletu aktynowego na przedniej krawędzi migrujących stożków wzrostu. Działanie cząsteczek atraktantów, takich jak NGF lub netryna, które szybko stymulują polimeryzację filamentów aktyny, objawia się jako lokalny wzrost liczby końców barbed aktyny, tworzonych poprzez przecinanie filamentów aktyny przez aktywowany ADF/cofilin10, co pokazano na Rysunkach 1...

<table><tbody><tr><td>szkiełko podstawowe 18x18 mm</td><td>Gold Seal</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego 35mm</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Cement akwariowy</td><td></td><td>silikon akwariowy DAP 100%</td><td>dowolny sklep budowlany</td></tr><tr><td>Poly-D-lizyna (mw &amp;gt; 300,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td></td></tr><tr><td>Naturalna laminina mysia</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>L1 CAM</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>777-NC</td><td></td></tr><tr><td>faloidyna Alexa-fluor 350</td><td>Invitrogen</td><td>A22281</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina przeciwko aktynie pozamięśniowej</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana F12</td><td>Invitrogen</td><td>21700-075</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Slowfade</td><td>Invitrogen</td><td>536937</td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie końców typu barbed f-aktyny rodaminą-aktyną w permeabilizowanych stożkach wzrostu neuronów

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Ruchome końce rosnących aksonów nazywa się stożkami wzrostu. Stożki wzrostu prowadzą nawigujące aksony przez rozwijające się tkanki, oddziałując z lokalnie ekspresowanymi molekularnymi sygnałami kierującymi, które wiążą się z receptorami stożka wzrostu i regulują dynamikę oraz organizację cytoszkieletu stożka wzrostu3-6. Głównym celem tych sygnałów nawigacyjnych jest sieć filamentów aktynowych wypełniająca peryferie stożka wzrostu, która napędza jego ruchomość poprzez ciągłą polimeryzację aktyny i dynamiczne przebudowywanie7. Pozytywne lub przyciągające sygnały kierujące indukują skręcanie stożka wzrostu poprzez stymulację polimeryzacji filamentów aktynowych (F-aktyny) w obszarze peryferiach stożka wzrostu położonym bliżej źródła sygnału przyciągającego. Polimeryzacja aktyny ta napędza lokalne wysuwanie się stożka wzrostu, adhezję krawędzi prowadzącej oraz wydłużanie aksonu w kierunku atraktanta.
Polimeryzacja filamentów aktynowych zależy od dostępności odpowiedniej ilości monomeru aktyny oraz od jąder polimeryzacji lub końców „barbed” filamentów aktynowych, do których przyłącza się monomer. Monomer aktyny występuje w obfitości w stożkach wzrostu siatkówki oraz zwojów korzeni grzbietowych (DRG) kurczaka. W konsekwencji polimeryzacja gwałtownie przyspiesza, gdy dostępne stają się wolne końce „barbed” F-aktyny dla przyłączania monomerów. W stożkach wzrostu DRG i siatkówki kurczaka dzieje się to poprzez lokalną aktywację białka przecinającego F-aktynę – czynnika depolimeryzującego aktynę (ADF/kofilin) w obszarze stożka wzrostu znajdującym się bliżej atraktanta8-10. Zwiększona aktywność ADF/kofiliny przecina filamenty aktynowe, tworząc nowe końce „barbed” F-aktyny dla polimeryzacji. Poniższa metoda demonstruje ten mechanizm. Całkowita zawartość F-aktyny jest wizualizowana poprzez barwienie fluorescencyjną faloidyną. Końce „barbed” F-aktyny są wizualizowane poprzez wbudowanie rodaminy-aktyny w stożkach wzrostu, które zostały permeabilizowane zgodnie z opisaną poniżej procedurą, zaadaptowaną z wcześniejszych badań nad innymi ruchomymi komórkami11, 12. Gdy rodaminę-aktynę dodaje się w stężeniu powyżej stężenia krytycznego dla przyłączania monomeru aktyny do końców „barbed”, rodamina-aktyna składa się na wolnych końcach „barbed”. Jeśli sygnał przyciągający jest prezentowany w gradiencie, na przykład poprzez uwalnianie go z mikropipety umieszczonej po jednej stronie stożka wzrostu, wbudowanie rodaminy-aktyny w końce „barbed” F-aktyny będzie większe po stronie stożka wzrostu zwróconej w stronę mikropipety10.
Stożki wzrostu są małymi i delikatnymi strukturami komórkowymi. Procedury permeabilizacji, inkorporacji rodaminy-aktyny, fiksacji oraz wizualizacji fluorescencyjnej są wykonywane z dużą starannością i mogą być przeprowadzone bezpośrednio na stole mikroskopu odwróconego. Metody te mogą być zastosowane do badania lokalnej polimeryzacji aktyny w migrujących neuronach, innych pierwotnych komórkach tkankowych lub liniach komórkowych.

Opisano metodę wizualizacji i kwantyfikacji końców barbed F-aktyny w stożkach wzrostu neuronów. Po hodowli neuronów na szkiełkach podstawowych, komórki poddaje się permeabilizacji za pomocą roztworu zawierającego saponinę. Następnie krótka inkubacja w buforze z saponiną zawierającym rodaminę-aktynę pozwala na wbudowanie fluorescencyjnej aktyny w wolne końce barbed aktyny.

Znakowanie końców typu barbed F-aktyny rodaminą-aktyną w permeabilizowanych stożkach wzrostu neuronów

Ruchome końcówki rosnących aksonów nazywa się stożkami wzrostu. Stożki wzrostu prowadzą nawigujące aksony przez rozwijające się tkanki, wchodząc w interakcje z lokalnymi...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja lokalizacji i liczby wolnych końców barbed f aktyny, które są dostępne dla polimeryzacji aktyny w stożkach wzrostu neuronów poddanych działaniu czynników kierujących wzrostem aksonów. Osiąga się to poprzez uprzednie kąpiel w buforze zawierającym saponinę neuronów hodowanych na szkiełkach podstawkowych, aby uczynić stożki wzrostu przepuszczalnymi. Następnie komórki poddaje się działaniu buforu zawierającego aktynę z rumianem przez cztery minuty, aby umożliwić aktynie z rumianem wniknięcie do stożków wzrostu i polimeryzację na wolnych końcach barbed f aktyny.Na koniec komórki są utrwalane chemicznie i płukane w celu zachowania rozkładu aktyny F. Końce zakotwiczone (barbed ends), które włączyły aktynę ruminiową. Na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej i ilościowej analizy obrazów uzyskuje się wyniki wykazujące, że atrakcyjne sygnały naprowadzające zwiększają liczbę wolnej aktyny F.Końce barbowe na krawędzi czołowej migrujących stożków wzrostu. Dzień dobry, nazywam się Paul Erno i reprezentuję Katedrę Neuronauki na Wydziale Medycznym Uniwersytetu Minnesoty. Dzisiaj zaprezentujemy sposób przygotowania kultur stożków wzrostu neuro

labeling-f-actin-barbed-ends-with-rhodamine-actin-permeabilized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Oznaczanie końców ostrych F-aktyny za pomocą rodaminy-aktyny w permeabilizowanych stożkach wzrostowych neuronów

Aby zrozumieć, w jaki sposób podczas rozwoju kształtowane są złożone formy komórek, takie jak dendryty neuronalne, kluczowa jest możliwość dokładnego badania organizacji mikrotubul. W niniejszej pracy opisujemy niezawodną metodę znakowania immunohistologicznego służącą do badania organizacji mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych o rozgałęzionym drzewku dendrytycznym, w tchawce, mięśniach oraz innych tkankach ściany ciała larwy Drosophila.

Immunohistochemiczne znakowanie mikrotubul w dendrytach neuronów sensorycznych, tchawkach i mięśniach ściany ciała larwy Drosophila

Ten film demonstruje procedurę fluorescencyjnego barwienia neuronów korowych szczurów do mikroskopii. Jest ukierunkowany na F-aktynę i białka dendrytyczne w celu analizy integralności strukturalnej i obliczenia gęstości F-aktyny, co ma kluczowe znaczenie dla badania funkcji i zdrowia neuronów.

Kwantyfikacja nitkowatej aktyny punktowej w neuronach kory mózgowej szczura

Źródło: Alluri, H., et al. Deprywacja tlenowo-glukozowa i reoksygenacja jako model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego in vitro do badania dysfunkcji bariery krew-mózg. J. Vis. Exp. (2015). Film pokazuje fluorescencyjną lokalizację białek połączeń ścisłych i włókien stresowych w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu szczura (RBMEC). W zestresowanej monowarstwie przeciwciała znakowane fluorescencyjnie są używane do znakowania białek połączeń ścisłych, podczas gdy znakowana...

Lokalizacja fluorescencyjna białek połączeń ścisłych i włókien stresowych w komórkach śródbłonka

Opisujemy metodę znakowania białka na powierzchni żywych neuronów za pomocą specyficznego poliklonalnego przeciwciała przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym. Białko związane przez przeciwciało na powierzchni komórki, a następnie internalizowane przez endocytozę, można odróżnić od białka pozostającego na powierzchni lub transportowanego na powierzchnię podczas inkubacji.

Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Nitkowata aktyna (F-aktyna) odgrywa ważną rolę w spinogenezie, plastyczności synaptycznej i stabilności synaptycznej. Kwantyfikacja F-aktyny puncta jest zatem użytecznym narzędziem do badania integralności struktur synaptycznych. Protokół ten opisuje procedury ilościowego oznaczania F-aktyny puncta znakowanej falloidyną w pierwotnych kulturach neuronów korowych o niskiej gęstości.

Kwantyfikacja punkcji aktyny nitkowatej (F-aktyny) w neuronach korowych szczurów

Wczesne funkcje endosomów zależą od polimeryzacji F-aktyny. W tym miejscu opisujemy oparty na mikroskopii test in vitro, który odtwarza zarodkowanie i polimeryzację F-aktyny na wczesnych błonach endosomalnych w probówkach, czyniąc w ten sposób tę złożoną serię reakcji podatną na manipulacje biochemiczne i genetyczne.

In vitro Polimeryzacja F-aktyny na wczesnych endosomach

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Przedstawiamy prosty, efektywny czasowo i wysokoprzepustowy test oparty na spektroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania włókien aktynowych w próbkach biologicznych ex vivo z tkanek mózgowych gryzoni i ludzi.

Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Aby się rozwijać, stożki wzrostu muszą wywierać siłę napędową na środowisko zewnętrzne. Wytwarzanie sił uciągu zależy od dynamiki aktyny i sprzężenia sprzęgła. W niniejszej pracy opisano metody analizy dynamiki aktyny, sprzęgu sprzęgła i sił trakcyjnych dla wyprzedzenia stożka wzrostu.

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

Poznaj metodę znakowania kolczastych końców F-aktyny rodaminy-aktyną w przepuszczalnych stożkach wzrostu neuronów. Technika ta umożliwia wizualizację dynamiki aktyny pod wpływem sygnałów naprowadzających.

Znakowanie końców typu barbed F-aktyny rodaminą-aktyną w permeabilizowanych stożkach wzrostu neuronów

Przeglądaj więcej filmów