JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:27 min • September 26th, 2025
Zacznij od hodowli E. coli wstępnie potraktowanej antybiotykiem.
Antybiotyk ten blokuje podziały komórkowe, w wyniku czego powstają wydłużone komórki nitkowate o zwiększonej zawartości DNA.
Umieść porcję kultury na bogatej w składniki odżywcze płytce agarowej i inkubuj.
Komórki nitkowate nie dzielą się pomimo ciągłego wzrostu; Tylko komórki nienitkowate tworzą kolonie, co skutkuje niską liczbą kolonii.
Rozcieńczyć pozostałą kulturę bakteryjną i dodać fluorescencyjny barwnik wiążący DNA. Następnie wysiaduj w ciemności.
Barwnik dostaje się do komórek i wiąże się z DNA.
Odwirować próbkę, a następnie przepuścić ją przez cytometr przepływowy.
Ilość rozproszonego światła z każdej komórki odpowiada jej rozmiarowi.
Podobnie fluorescencja emitowana przez kwasy nukleinowe związane z barwnikiem wskazuje na zawartość bakteryjnego DNA.
Komórki poddane działaniu antybiotyków wykazują zwiększone rozproszenie i fluorescencję, co odzwierciedla nitkowaty wzrost i ciągłą replikację DNA bez podziału.
Świadczy to o modyfikacjach w fizjologii bakterii spowodowanych przez antybiotyki hamujące podziały komórkowe.
Przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia, do 10 do minus siódmej, z 200 mikrolitrów próbki hodowli w świeżej pożywce.
Mieszać między każdym rozcieńczeniem, bardzo delikatnie wirując lub odwracając probówkę. Na niewybranych płytkach z agarozy LB rozmieścić 100 mikrolitrów odpowiedniego rozcieńczenia i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia policz liczbę kolonii, aby określić stężenie żywotnych komórek w każdej próbce hodowli.
Wykreślić jtk na mililitr w funkcji czasu dla kultur komórkowych niepoddanych działaniu substancji i poddanych działaniu środka. Zmierz OD 600 kultury na spektrofotometrze. Rozcieńczyć próbkę hodowli świeżą pożywką w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby otrzymać próbkę o OD 600 w 0,06, co odpowiada około 15 000 komórek na mikrolitr.
W przypadku barwienia DNA należy zmieszać rozcieńczoną próbkę bakteryjną z roztworem fluorescencyjnym DNA o stężeniu 10 mikrogramów na mililitr w stosunku objętościowym jeden do jednego i inkubować w ciemności przez 15 minut. Przed wstrzyknięciem próbki należy wymieszać próbkę przez bardzo delikatne wirowanie lub odwrócenie probówki. Przepuścić próbkę do cytometru przepływowego z natężeniem przepływu około 120 000 komórek na minutę.
Pozyskiwanie światła rozproszonego do przodu i bocznego, a także barwnika fluorescencyjnego DNA/sygnału fluorescencyjnego z odpowiednimi ustawieniami.