Kolorymetryczne wykrywanie degradacji kory mózgowej podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych

Zarodnik bakterii pozostaje uśpiony z powodu warstwy kory peptydoglikanu, polimeru cukrów i aminokwasów.

Podczas kiełkowania kora ulega degradacji, aby uwolnić cukry do otaczającego podłoża.

Aby wykryć degradację kory mózgowej, zacznij od pożywki zawierającej uwolnione cukry, zebrane w określonych punktach czasowych podczas kiełkowania zarodników.

Dla celów informacyjnych należy stosować rosnące stężenia norm cukru.

Wzorce i próbki poddano wcześniejszej obróbce w celu przekształcenia cukrów w formę reaktywną.

Inkubować z odczynnikiem Ehrlicha, odczynnikiem do wykrywania kolorymetrycznego, który reaguje z cukrami i tworzy kompleks o fioletowym kolorze.

Przenieść mieszaniny na płytkę wielodołkową i zmierzyć absorbancję kolorowych kompleksów za pomocą czytnika mikropłytek.

Absorbancja odpowiada intensywności koloru fioletowego, która jest wprost proporcjonalna do stężenia cukru.

Wzrost absorbancji w próbkach w punktach czasowych wskazuje na postępującą degradację kory.

Wygeneruj wykres na podstawie stężeń wzorcowych i określ ilościowo stężenia próbki.

Gdy próbki znajdują się na lodzie, przygotuj odczynnik barwiący. Rozpuść 0,320 grama DMAB w 1,9 mililitra lodowatego kwasu octowego. Należy pamiętać, że ten odczynnik jest wrażliwy na czas, temperaturę i światło i nie powinien być wykonywany z wyprzedzeniem.

Po całkowitym rozpuszczeniu DMAB dodać 100 mikrolitrów 10 normalnych kwasów solnych i odwirować próbkę. Następnie dodaj pięć mililitrów lodowatego kwasu octowego i ponownie wiruj. W przypadku reakcji kolorymetrycznej przenieś 100 mikrolitrów każdej schłodzonej kory lub próbki kontrolnej do nowej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Do każdej próbki dodać 700 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu barwnego. Natychmiast przenieść próbki do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubować próbki dokładnie przez 20 minut. Po inkubacji przenieść 200 mikrolitrów każdej próbki na przezroczystą 96-dołkową płytkę.

Próbki powinny być początkowo koloru żółtego, ale zmienią kolor na fioletowy, jeśli obecny jest cukier redukujący, który wskazuje na obecność kory. W tym przypadku wiele próbek nie ma widocznego fioletowego koloru. Jednak próbki 250, 500 i 5000 nanomoli wydają się wizualnie różnić od nanomoli zero kontroli negatywnej.

Za pomocą czytnika płytek określ absorbancję przy 585 nanometrach. Przy pomiarze w średnicy zewnętrznej 585 nanometrów, sygnał generowany z próbek wzorcowych najlepiej pasuje do regresji liniowej.