Produkcja i odzyskiwanie białek rekombinowanych z pęcherzyków pochodzących od bakterii

Zacznij od hodowli gatunku bakterii, który koduje rekombinowane białka oznaczone peptydem zarodkującym pęcherzyki lub VNp, krótkim peptydem, który sprzyja tworzeniu pęcherzyków.

Dodaj induktor do kultury i inkubuj. Induktor wyzwala ekspresję białka.

VNp osadza się w błonie wewnętrznej i wspomaga krzywiznę błony, zamykając białka znakowane VNp w pączkujących pęcherzykach.

Przenieś pożywkę bogatą w pęcherzyki do probówki. Odwirować go, aby oddzielić supernatant bogaty w pęcherzyki.

Następnie przefiltruj supernatant, aby usunąć resztki zanieczyszczeń.

Następnie przepuść filtrat przez inny filtr membranowy, aby wychwycić pęcherzyki na powierzchni membrany.

Umieść membranę w naczyniu i dodaj sól fizjologiczną buforowaną fosforanami.

Delikatnie odłączyć pęcherzyki i przenieść zawiesinę do czystej tubki.

Sonizować zawiesinę, aby rozerwać błony pęcherzykowe i uwolnić białka.

Odwirować lizat w celu oddzielenia fragmentów błony.

Otrzymany supernatant zawiera oczyszczone białka rekombinowane, gotowe do analizy.

Indukuj ekspresję białka rekombinowanego z promotora T7, dodając IPTG do końcowego stężenia do 20 mikrogramów na mililitr lub 84 mikromolowe. Po pozostawieniu wystarczającej ilości czasu na indukcję, osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 3000 g i 4 stopni Celsjusza przez 20 minut. Przepuść supernatant przez sterylny i wolny od detergentów filtr PES o grubości 0,45 mikrona, aby wysterylizować pożywkę zawierającą pęcherzyki do długotrwałego przechowywania.

Aby skoncentrować pęcherzyki w mniejszej objętości, przepuść sterylne podłoże zawierające pęcherzyki przez sterylny i wolny od detergentów filtr MCE 0,1 mikrona. Następnie delikatnie umyj membranę 0,5 do 1 mililitra sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS i użyj skrobaka do komórek lub plastikowego rozsiewacza, aby ostrożnie usunąć pęcherzyki z membrany. Przenieść koncentrat pęcherzyków do świeżej probówki do mikrowirówki za pomocą pipety.

Oczyszczone pęcherzyki można przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Sonikować białko zawierające pęcherzyki w sterylnym podłożu przy użyciu odpowiedniego harmonogramu, aby rozerwać błony lipidowe pęcherzyków i uwolnić białko. Odwirować sonikowaną zawiesinę w temperaturze 39 000 g i 4 stopnie Celsjusza przez 20 minut, aby usunąć resztki pęcherzyków.