Name: Opracowanie ujemnego markera selekcyjnego dla Entamoeba histolytica (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-12T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Poznaj system negatywnej selekcji FCU1 dla Entamoeba histolytica wykorzystujący prolek 5-fluorocytozynę. Ta metoda umożliwia selektywną eliminację komórek transfekowanych i usuwanie plazmidów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować dr. Philippe'owi Erbsowi za udostępnienie nam sekwencji genu FCU1. Praca ta była finansowana z grantu NIH AI 26649.

1. System negatywnej selekcji FCU w Entamoeba histolytica
<ol>
<li>Linia kontrolna wektora (HM1/ pKT3M) oraz linia eksperymentalna (HM1/pKT3M-FCU1) zostały wytworzone zgodnie z wcześniej opisanymi technikami1,2. Przenieść linie badawcze z probówek zapasowych do kolbek T-25 i utrzymać selekcję poprzez dodanie odpowiedniego antybiotyku (12 μg/ mL G418) w pożywce TYI-S-33. Kolbki powinny osiągnąć 70-80% konfluencji po 16-18 godzinach wzrostu w temperaturze 37°C.</li>
<li>Przygotować świeży 50mM roztwór zapasowy 5-fluorocytosyny (5-FC, Sigma) w ciepłej pożywce TYI-S-3. Intensywnie mieszać w wortexie przez kilka minut do całkowitego rozpuszczenia 5-FC. Roztwór zapasowy wysterylizować przez filtrację, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm.</li>
<li>Zebrać trofozoity, umieszczając kolbki na lodzie przez 3-5 minut, a następnie odwirować komórki przy 20xg przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Osad zawiesić w świeżej pożywce TYI i policzyć komórki.</li>
<li>Projekt typowego eksperymentu zakłada użycie 0,5 x 104 komórek na każdą studzienkę płytki 48-dołkowej w końcowej objętości 1 mL; każda warunek testowy powtarzany jest w trzech powtórzeniach. Dodatkowo, aby ułatwić pomiary fluorescencji, dla każdego szczepu i każdego punktu czasowego stosuje się oddzielną płytkę.</li>
<li>Zasiać 0,5 x 104 komórek na studzienkę dla każdego testowanego stężenia 5-FC, w trzech powtórzeniach. Utrzymać presję selekcyjną antybiotyku w pożywce TYI. Następnie dodać do każdej studzienki wymaganą ilość roztworu zapasowego 5-FC oraz trofozoity.</li>
<li>Inkubować płytki w worku beztlenowym w temperaturze 37°C.</li>
</ol>
2. Wyznaczanie wydajności selekcji
<ol>
<li>Przygotować roztwór stokowy Cell tracker green CMFDA (Invitrogen) o stężeniu 2 mg/mL w DMSO. Aby przygotować roztwór roboczy, należy rozcieńczyć roztwór stokowy 10-krotnie w bezserwatkowym medium TYI.</li>
<li>Całkowicie usunąć medium z płytek z kulturą trofozoitów i zastąpić je 150 μL bezserwatkowego medium TYI zawierającego CMFDA. Kontynuować inkubację w temperaturze 37°C przez 1 h.</li>
<li>Usunąć roztwór barwnika z dołków i odczytać wartości na płytce za pomocą spektrofluorometru do mikropłytek Spectramax M2. Długość fali wzbudzenia powinna być ustawiona na 492 nm, a emisja fluorescencji odczytywana przy 417 nm.</li>
<li>Porównać wartości fluorescencji dla komórek kontrolnych oraz testowanych transfektantów.</li>
<li>Kontynuować odczyty z płytek w każdym wyznaczonym odstępie czasu. W każdej płytce należy zastosować odpowiednie dołki kontrolne dodatnie (tylko TYI) i ujemne (25 μg/mL hygromycyny).</li>
</ol>

3. Reprezentatywne wyniki 
Transfektanty E. histolytica wykazały silną ekspresję rekombinowanego FCU1 o zoptymalizowanych kodonach (Rycina 1). Prawidłowe zastosowanie tego protokołu prowadzi do selektywnej eliminacji komórek E. histolytica wykazujących ekspresję FCU1 w obecności 0,5 mM 5-fluorocytosyny. Komórki kontrolne, w przeciwieństwie do powyższych, nadal rosną normalnie przy stężeniu 5-FC do 5 mM i osiągają konfluencję w czasie od 72 do 96 h (Rycina 2-a). Komórki niosące FCU1 po 48 h ulegają całkowitej lizie, co jest widoczne podczas obserwacji traktowanych studni pod mikroskopem. Wykazują one również zmniejszoną fluorescencję po barwieniu barwnikiem żywotności CMFDA, który jest stosowany w badaniach ilościowych obejmujących dużą liczbę próbek (rycina 2-b). System FCU1/5-FC stanowi skuteczne i wydajne narzędzie do selekcji negatywnej trofozoitów E. histolytica.
<img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig1.jpg" alt="Western blot oraz wykres słupkowy przedstawiające ekspresję białka anty-Myc oraz znormalizowaną ekspresję FCU1 w transfektantach E. histolytica." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Generowanie E. histolytica Transfektanty HM1 wykazujące ekspresję negatywnego markera selekcyjnego 
(a) Rekombinacyjne białko FCU1 wykryto metodą western blot przy użyciu przeciwciała anty-c Myc (panel górny). Zgodnie z oczekiwaniami, prążek o masie 42 kDa (wskazany strzałką) był widoczny w całkowitym lizacie z transfektantów FCU, ale nie w transfektantach kontrolnych z samym wektorem. Panel dolny przedstawia ten sam blot poddany inkubacji z przeciwciałem anty-aktyną w celu kontroli ilości białka (loading control). (b) Wyniki ilościowego PCR w czasie rzeczywistym wykazujące ekspresję swoistego mRNA FCU1 znormalizowaną do kontroli lgl4.

<img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig2.jpg" alt="Wykresy analizy fluorescencji obrazujące wpływ stężenia na fluorescencję w czasie w badaniu eksperymentalnym." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. In vitro wrażliwość na lek w przypadku *E. histolytica* transfekty wyrażające negatywny marker selekcyjny 
Krzywe przeżycia (a) transfekty kontrolne i (b) transfektanty wykazujące ekspresję FCU1 hodowane na płytce 48-dołkowej. Komórki hodowano w obecności zwiększających się stężeń proleku – 5-fluorocytozyny; przeżywalność komórek określano za pomocą barwienia CMFDA w każdym przedziale czasowym wskazanym na osi X. Oś Y przedstawia jednostki fluorescencji i jest bezpośrednim odzwierciedleniem przeżywającej populacji komórek. Należy zauważyć, że transfektanty wykazujące ekspresję FCU1 wykazały znaczną wrażliwość przy stężeniu proleku 0,5 mM w porównaniu z grupą kontrolną. W tych dołkach nie zaobserwowano komórek w punkcie czasowym 120 h, w przeciwieństwie do konfluencyjnego wzrostu widocznego pod mikroskopem w odpowiadających im dołkach kontrolnych (dane nie zostały przedstawione). Hygro oznacza 25μg/ mL hygromycyny użytej jako kontrola negatywna.

<ol><li>Olvera, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+Entamoeba+histolytica+trophozoites+by+lipofection%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection.</a> Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).</li>
<li>Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5-associated+vacuoles+play+a+unique+role+in+phagocytosis+of+the+enteric+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).</li>
<li>Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+medium+for+the+axenic+cultivation+of+Entamoeba+histolytica+and+other+Entamoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+R.+Soc.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).</li>
<li>Clark, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClark%2C+C+%22Anaerobic+parasitic+protozoa+%3A+genomics+and+molecular+biology%22">Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology</a>. , Caister Academic. Norfolk UK. (2010).</li>
<li>Linford, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA-mediated+knockdown+of+protein+expression+in+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica.</a> BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).</li>
<li>Solis, C. F., Guillén, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+genes+by+RNA+interference+in+the+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).</li>
<li>Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guillén, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacterially+expressed+dsRNA+to+downregulate+Entamoeba+histolytica+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression.</a> PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).</li>
<li>MacFarlane, R. C., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+dsRNA-based+gene+silencing+in+Entamoeba+histolytica%3A+implications+for+approaches+to+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Loss of dsRNA-based gene silencing in Entamoeba histolytica: implications for approaches to genetic analysis.</a> Exp. Parasitol. 119, 296-300 (2008).</li>
<li>Dhar, S. K., Vines, R. R., Bhattacharya, S., Petri, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+DNA+fragments+enhance+the+stability+of+transfected+DNA+in+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Eukaryot.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ribosomal DNA fragments enhance the stability of transfected DNA in Entamoeba histolytica.</a> J. Eukaryot. Microbiol. 45, 656-660 (1998).</li>
<li>Erbs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cancer+gene+therapy+by+adenovirus-mediated+transfer+of+a+bifunctional+yeast+cytosine+deaminase%2Furacil+phosphoribosyltransferase+fusion+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene.</a> Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).</li>
<li>Braks, J. A. M., Franke-Fayard, B., Kroeze, H., Janse, C. J., Waters, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+positive-negative+selectable+marker+system+for+use+in+reverse+genetics+in+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Development and application of a positive-negative selectable marker system for use in reverse genetics in Plasmodium.</a> Nucleic Acids Res. 34, e39-e39 (2006).</li>
<li>Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+selection+using+yeast+cytosine+deaminase%2Furacil+phosphoribosyl+transferase+in+Plasmodium+falciparum+for+targeted+gene+deletion+by+double+crossover+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).</li>
</ol>

Produkcja tego filmu została sfinansowana przez Sigma Aldrich, Inc, firmę produkującą część odczynników wykorzystanych w niniejszym artykule.

Mimo znacznych postępów w narzędziach biologii molekularnej dotyczących Entamoeba, obecnie nie istnieją dostępne metody usuwania lub zakłócania genów4. Wyciszenie specyficznej ekspresji genów osiągnięto poprzez zastosowanie rybinowych RNA (hairpin RNA)5, małych interferujących RNA6 oraz bakteryjnie ekspresowanego dsRNA7. Jednak metody te, choć skuteczne dla odpowiednich genów docelowych, mają kilka ograniczeń, w tym stosowanie kosztownych odczynników chemicznych, ciągłą selekcję przy użyciu antybiotyków oraz konieczność stałej walidacji ze względu na wysoką częstotliwość występowania rewersji w czasie (Alicia Linford, komunikacja osobista)8.
Każdy plazmid może replikować się w Entamoeba, ponieważ najwyraźniej nie istnieją rygorystyczne wymagania sekwencyjne dla miejsc inicjacji replikacji DNA9, przez co po transfekcji zazwyczaj trudno jest usunąć plazmid. Ogranicza to możliwość wykorzystania nienaruszonych plazmidów w eksperymentach z rekombinacją i knockoutem genów. Markery selekcji negatywnej są kluczowymi elementami metod celowania w geny, ponieważ mogą być wykorzystywane do eliminacji rekombinowanych subpopulacji. Z powodzeniem wyraziliśmy gen FCU1 o zoptymalizowanych kodonach w Entamoeba histolytica i przetestowaliśmy jego potencjał jako negatywnego markera selekcyjnego. Ta fuzja genowa była stosowana w terapii genowej typu „gen samobójczy” w komórkach nowotworowych ludzi i metabolizuje prolek 5-FC do toksycznych produktów końcowych, co prowadzi do zahamowania syntezy RNA i DNA10. FCU1 był ostatnio stosowany jako negatywny marker selekcyjny w Plasmodium, innym pierwotniaku pasożytniczym. Stwierdzono, że komórki Plasmodium berghei wykazujące ekspresję FCU1 są niemal 1000-krotnie bardziej wrażliwe na prolek in vitro, a leczenie 5-FC in vivo zabiło ponad 99,9% zakaźnych rekombinowanych pasożytów w mysim modelu malarii w stadium erytrocytarnym11. Komórki E. histolytica wykazujące ekspresję FCU1 wykazały jedynie 30-krotny wzrost wrażliwości na prolek 5-FC, w przeciwieństwie do wrażliwości zaobserwowanej u P. berghei. Możliwą przyczyną tego stanu może być duża pula nukleotydów dostępna w medium hodowlanym, konkurująca z toksycznymi metabolitami. 
Zarówno w P. berghei, jak i w P. falciparum marker FCU1 był wykorzystywany w badaniach nad celowaną disruptią genów11,12. Naszym celem jest manipulacja genomem Entamoeba przy użyciu rekombinacji homologicznej. Walidacja systemu selekcji negatywnej FCU1/5-FC jest istotnym krokiem w stronę osiągnięcia tego celu.

<table><tbody><tr><td>pożywka TYI-S-33</td><td>ATCC</td><td></td><td>Referencja zawarta w tekście</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F7129%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC">5-fluorocytozyna&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7129</td><td></td></tr><tr><td>Cell tracker green CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>czytnik płytek Spectra Max M2</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie markeru selekcji negatywnej dla entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica jest czynnikiem etiologicznym amebozy i infekuje do 10% populacji świata. Techniki molekularne umożliwiające nadekspresję i wyciszanie ekspresji genów opierają się na transfekcji stabilnie utrzymywanych plazmidów. Choć poszerzyły one naszą wiedzę na temat czynników wirulencji Entamoeba, możliwość integracji egzogennego DNA z genomem, co pozwoliłoby na przeprowadzenie eksperymentów z zakresu genetyki odwrotnej, stanowiłaby istotną zaletę w badaniach nad tym pasożytem. Wyzwania związane z tym organizmem obejmują brak możliwości selekcji zdarzeń rekombinacji homologicznej oraz trudności w usuwaniu episomalnego DNA plazmidowego z transfekowanych trofozoitów. To drugie prowadzi do wysokiego tła egzogennego DNA, co stanowi główny problem w identyfikacji trofozoitów, w których doszło do rzeczywistego zdarzenia integracji genomowej. Opisujemy opracowanie systemu selekcji negatywnej opartego na transgenicznej ekspresji chimery cytyzyny deaminazy i uracylu fosforobrylotransferazy drożdży (FCU1) oraz selekcji z użyciem proleku 5-fluorocytozyny (5-FC). Enzym FCU1 przekształca nietoksyczną 5-FC w toksyczny 5-fluorouracyl oraz 5-fluorurydynę-5'-monofosforan. Stwierdzono, że linie E. histolytica wykazujące ekspresję FCU1 są 30-krotnie bardziej wrażliwe na prolek w porównaniu ze szczepem kontrolnym.

Opisujemy opracowanie systemu selekcji negatywnej w E. histolytica opartego na transgenicznej ekspresji białka chimerycznego (FCU1) i selekcji przy użyciu proleku 5-fluorocytosyny. Białko FCU1 jest fuzją drożdżowej cytozynowej deaminazy i uracylu fosforobozylotransferazy. Ekspresja FCU1 doprowadziła do zwiększenia wrażliwości E. histolytica na 5-fluorocytosynę.

Opracowanie markeru selekcji negatywnej dla Entamoeba histolytica

*Entamoeba histolytica* jest czynnikiem etiologicznym amebiazy i zakaża do 10% populacji światowej. Techniki molekularne, które umożliwiły...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest walidacja zastosowania systemu 5-FC/FCU1 jako metody selekcji negatywnej w komórkach Enteramoeba histolytica. W 48-dołkowych płytkach wysiano E. histolytica, a następnie dokonano transfekcji linii wyrażających gen FCU1 lub odpowiednią kontrolę wektorową; komórki poddano działaniu proleku 5-FC. W komórkach wykazujących wysoką ekspresję FCU1 5-FC zostanie przekształcony w skuteczne ilości toksycznych produktów końcowych. Przeżywającą populację komórek barwi się CMFDA, aby wykazać selektywną eliminację komórek wyrażających FCU1 w obecności 5-FC oraz ilościowo porównać wydajność selekcji negatywnej. Ten system selekcji negatywnej pozwoli nam po raz pierwszy na usunięcie plazmidów episomalnych z transfektowanych komórek E. histolytica.Biorąc pod uwagę trudności związane z obecnością mechanizmów oporności na konwencjonalne manipulacje genetyczne, metoda ta może pozwolić na zaburzenie i usunięcie genów, a następnie na przetestowanie docelowych czynników VIR w naszym programie poszukiwania leków. Trofozoity mogą wykazywać różną zdolność do wzrostu w kulturach stokowych. Błąd na początkowym etapie może prowadzić do powstania artefaktów, dlatego krytycznym wczesnym krokiem jest kontrola jakości kultury wyjściowej.Przeszczep badane linie inba hisa z probówek zapasowych do kolb T 25 i utrzymuj selekcję poprzez dodanie odpowiedniego antybiotyku do pożywki TYIS 33. Inkubuj kolby w temperaturze 37 °C przez 16 godzin, aż kultury osiągną około 80% konfluencji. W tej procedurze zawsze przygotowuj świeży roztwór zapasowy 50 mM 5-fluorocytozyny (FC) w ciepłej pożywce TYIS 33.Pożywkę energicznie mieszaj w wstrząsarze w czasie kilku minut, aby całkowicie rozpuścić pięć FC, a następnie przefiltruj i wysterylizuj roztwór zapasowy przez filtr o rozmiarze 0.22 micron w celu zebrania trofozoitów. Kolby umieść w lodzie na trzy do pięciu minut, a następnie odseparuj komórki poprzez wirowanie przy 200 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Osad resuspenduj w świeżym pożywce TYI i dokonaj obliczenia liczby komórek, aby ułatwić późniejsze pomiary fluorescencyjne.Doświadczenia należy przeprowadzić w trzech powtórzeniach, używając oddzielnej płytki 48-dołkowej dla każdego szczepu w każdym punkcie czasowym. Do każdego dołka należy zasiać 0,5 × 10⁴ komórek w objętości 0,5 ml dla każdego z pięciu stężeń 5-FC, utrzymując presję selekcyjną antybiotyku w podłożu TYI. Następnie do każdego dołka należy dodać wymaganą ilość roztworu stokowego 5-FC, a następnie uzupełnić podłożem TYI do końcowej objętości 1 ml i inkubować płytki w worku beztlenowym w temperaturze 37 °C.Przygotuj roztwór zapasowy C-M-F-D-A cell tracker green o stężeniu dwóch mg/ml w DMSO. Następnie, aby przygotować roztwór roboczy, rozcieńcz roztwór zapasowy 1000-krotnie w bezsurowiczym medium TYI w określonych punktach czasowych eksperymentu. Całkowicie usuń medium z płytek hodowlanych Tropho Xite i zastąp je 150 µl bezsurowiczego medium TYI zawierającego C-M-F-D-A.Kontynuuj inkubację w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę, a następnie odessaj roztwór DI z dołków. Na koniec odczytaj płytkę w spektrofluorometrze do mikropłytek SpectraMax M2, stosując długość fali wzbudzenia 492 nm i emisję fluorescencji 517 nm. Porównaj wartości fluorescencji dla komórek kontrolnych i komórek poddanych transfekcji testowej.Kontynuuj odczytywanie płytek w każdym odstępie czasu. Zawsze stosuj odpowiednie studzienki kontrolne pozytywne i negatywne na każdej płytce. Analizy Western blot wykazują pomyślne wytworzenie transfektu lya wykazującego ekspresję chimery FCU one, cytyzynianu deaminazy drożdżowej i uracylu fosforibosylotransferazy.Wyniki te odzwierciedlają również pomiary ilościwego PCR. W obecności pięciofluorouracylu komórki kontrolne rosną prawidłowo przy stężeniu do 5 mM i osiągają konfluencję między 72 a 96 godzinami. W przeciwieństwie do nich, komórki E. histolytica wykazujące ekspresję FCU1 są selektywnie eliminowane w obecności 0,5 mM proleku, co stwierdzono w badaniu pod mikroskopem świetlnym.Selektywna odpowiedź komórek E. histolytica wykazujących ekspresję FCU na lek FC Pro jest widoczna poprzez przejaśnienie (lizę) komórek. W tym przypadku hodowla jest prowadzona przez 72 h po transfekcji. Podczas przeprowadzania tego eksperymentu ważne jest, aby monitorować wzrost w każdym punkcie czasowym.Metoda ta może być wykorzystana w mutagenezie typu „hit and run”, której użyjemy do odpowiedzi na istotne pytania dotyczące wirulencji Inba Hisa.

development-of-a-negative-selectable-marker-for-entamoeba-histolytica

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opracowanie ujemnego markera selekcyjnego dla Entamoeba histolytica

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie syntetycznego substratu tRNA dla homologu metylotransferazy DNA/tRNA 2 (Dnmt2) z Entamoeba histolytica, Ehmeth, oraz pomiar jego aktywności metylotransferazy. To podejście eksperymentalne może być wykorzystane do badania aktywności innych białek Dnmt2.

Analiza metylacji tRNA in vitro z użyciem enzymu DNA i tRNA metylotransferazy Dnmt2 (Ehmeth) z Entamoeba histolytica

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty protokół tworzenia losowej biblioteki mutantów dla określonej sekwencji docelowej. Pokazujemy, w jaki sposób metoda ta, realizowana in vivo w Escherichia coli, może być łączona z selekcją funkcjonalną w celu wyewoluowania nowych aktywności enzymatycznych.

Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w E. coli

Opisano model in vitro sekwestracji w malarii mózgowej1. Krwinki czerwone zakażone Plasmodium falciparum są selekcjonowane pod kątem wiązania się z unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami śródbłonka mikrokrążenia mózgowego. Wyselekcjonowane pasożyty wykazują wyraźny fenotyp. Proces selekcji można zastosować w przypadku różnych szczepów P. falciparum oraz linii komórek śródbłonka.

Wybór pasożytów Plasmodium falciparum pod kątem cytoadhezji do ludzkich komórek śródbłonka mózgu

Genetyka forward jest potężną metodą pozwalającą na odkrycie mechanizmów molekularnych, za pomocą których Toxoplasma opuszcza komórkę gospodarza. Przedstawione protokoły obejmują chemiczną mutagenizację pasożytów, wzbogacanie populacji mutantów z defektami indukowanego opuszczania komórki oraz walidację fenotypu sklonowanych mutantów.

Przesiew genetyczny w celu wyizolowania mutantów Toxoplasma gondii zaburzających wyjście z komórki gospodarza

Zakażenie człowieka przez Entamoeba histolytica prowadzi do amebii, głównej przyczyny biegunki w krajach tropikalnych. Zakażenie jest inicjowane przez interakcje patogenu z komórkami nabłonka jelitowego, powodując otwarcie kontaktów komórka-komórka, a w konsekwencji biegunkę, po której czasami następuje zakażenie wątroby. W tym artykule przedstawiono model do oceny wczesnych interakcji gospodarz-patogen, aby lepiej zrozumieć patogenezę amebiozy.

Analiza uszkodzeń nabłonka wywołanych zakażeniem Entamoeba histolytica

Opisana tutaj jest metoda celowanej, bezznacznikowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasecie floksowanej, FLAEM.

Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis

Tutaj opisujemy metodologię używaną do generowania szczepów L. panamensis i L. donovani wyrażających gen eGFP jako stabilny zintegrowany transgen za pomocą systemu pLEXSY. Transfekowane pasożyty klonowano poprzez ograniczenie rozcieńczenia, a klony o najwyższej intensywności fluorescencji u obu gatunków wybrano do dalszego wykorzystania w testach przesiewowych leków.

Rozwój szczepów gatunków Leishmania z konstytutywną ekspresją eGFP

Wykorzystując łatwo dostępne materiały, ten system kompostowania w warunkach biocontainment umożliwia skutylną utylizację na miejscu dużych trucheł zwierząt powstałych w przypadku wybuchu choroby zakaźnej. Procedura ta eliminuje większość czynników zakaźnych w truchełkach oraz zanieczyszczonym oborniku. Po potwierdzeniu, że czynnik zakaźny nie jest już żywotny, dojrzały kompost można rozprowadzić jako nawóz.

Kompostowanie padliny w systemie zamkniętym w celu opanowania ogniska choroby zakaźnej u zwierząt hodowlanych

Przedstawiamy metodę opartą na cytometrii przepływowej do badania rozwoju limfocytów T in vivo z wykorzystaniem myszy modyfikowanych genetycznie na tle typu dzikiego lub transgenicznych pod kątem receptora limfocytów T.

Badanie pozytywnej i negatywnej selekcji w grasicy metodą cytometrii przepływowej

Poznaj system negatywnej selekcji FCU1 dla Entamoeba histolytica wykorzystujący prolek 5-fluorocytozynę. Ta metoda umożliwia selektywną eliminację komórek transfekowanych i usuwanie plazmidów.

Opracowanie markeru selekcji negatywnej dla Entamoeba histolytica

Przeglądaj więcej filmów