Przesiewowe inhibitory pirofosfatazy związanej z błoną bakteryjną za pomocą testu kolorymetrycznego

Pirofosfataza związana z błoną bakteryjną lub mPPaza hydrolizuje pirofosforan do ortofosforanu, jednocześnie pompując jony sodu przez błonę.

Aby ocenić działanie inhibitorów na mPPazy, należy dodać rosnące stężenia wzorców fosforanowych do pasków probówek.

Wprowadzić badane związki, które mogą hamować mPPazę, do probówek, pozostawiając jedną z wodą jako kontrolą.

Dodaj osadzone w liposomach mPPazy pochodzące z ciepłolubnej bakterii Thermotoga maritima do wszystkich probówek z wyjątkiem wzorców.

Zamknąć i inkubować w optymalnej temperaturze, aby aktywować enzym.

Dodaj pirofosforan sodu, aby zainicjować reakcję i uwolnić ortofosforan.

Przenieś probówki na platformę chłodzącą, aby zatrzymać reakcję i odwirować, aby usunąć kondensację.

Dodać odczynnik molibdenian-askorbinian, aby zareagował z ortofosforanem i wytworzył kwas fosfomolibdenowy.

Dodaj roztwór cytrynianu arsenitu, aby zredukować kwas, tworząc stabilny niebieski kompleks.

Przenieść zawartość na płytkę wielodołkową i zmierzyć absorbancję.

Niższa absorbancja w porównaniu z kontrolą wskazuje na hamowanie mPPazy, podczas gdy wzorce służą jako odniesienie do oznaczania ilościowego fosforanów.

Dodaj jeden mililitr roztworu B do 10 mililitrów