JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:04 min • October 30th, 2025
Zacznij od komórek ameba Dictyostelium discoideum typu dzikiego zawieszonych w zimnym buforze.
Bufor zapewnia środowisko jonowe, które utrzymuje stabilność membrany.
Następnie dodaj komórki ameby do probówki zawierającej plazmid z docelowym genem.
Delikatnie wymieszaj roztwór, aby plazmidy znalazły się w bliskim kontakcie z powierzchnią ameby.
Przenieś tę mieszaninę do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji i wykonaj elektroporację.
Podczas elektroporacji impulsy elektryczne tworzą przejściowe pory w błonie komórkowej.
Plazmid dostaje się przez te pory do cytoplazmy, a następnie przemieszcza się do jądra.
Następnie przenieś komórki ameby na szalkę Petriego zawierającą płynne podłoże uzupełnione bakteriami żywicielskimi.
Ameba zjada bakterie poprzez fagocytozę, dostarczając niezbędnych składników odżywczych do regeneracji komórek i umożliwiając ekspresję plazmidu.
Bakterie żywicielskie wspomagają transfekcję w komórkach ameby typu dzikiego, bez potrzeby stosowania specjalnych szczepów, które rosną bez bakterii.
Ponownie zawieś komórki w buforze H40.
Następnie dodaj 100 mikrolitrów komórek do probówki zawierającej od jednego do dwóch mikrogramów DNA. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać i przenieść mieszaninę DNA komórki do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji.
Nie należy dodawać więcej niż dwóch mikrogramów DNA. Wyższe stężenie DNA jest toksyczne dla komórek i zmniejsza wydajność.
Po elektroporacji natychmiast przenieś komórki na przygotowaną 10-centymetrową szalkę Petriego i pozwól komórkom zregenerować się przez pięć godzin.