JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 4:16 min. • October 30th, 2025
Weź lizat bakteryjny zawierający hydrofilowe białka, lipoproteiny i agregaty białkowe.
Dodaj zimny, niejonowy detergent zdolny do separacji faz w wyższych temperaturach.
Inkubować na lodzie i okresowo mieszać. Detergent wiąże się z ugrupowaniem lipidowym lipoproteiny, tworząc kompleksy białkowo-detergentowe.
Podgrzej mieszaninę, aby wywołać separację faz. Lipoproteiny koncentrują się w fazie detergentu, podczas gdy białka hydrofilowe pozostają w fazie wodnej.
Odwirować w temperaturze pokojowej, aby utrzymać dwufazową separację.
Odrzuć fazę wodną, dodaj zimny bufor do fazy detergentu i wymieszaj.
Powtórz cykl chłodzenia, ogrzewania i wirowania, aby wzbogacić lipoproteiny.
Następnie dodaj zimny bufor i odwiruj w niskiej temperaturze, aby zagnieździć agregaty nielipoproteinowe.
Przenieść supernatant do probówki zawierającej rozpuszczalnik wytrącający białka i inkubować w temperaturze poniżej zera w celu wytrącenia lipoprotein.
Odwirować w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
Wytrącone lipoproteiny są gotowe do dalszych badań.
Uzupełnij supernatant środkiem powierzchniowo czynnym TX-114 do końcowego stężenia 2%, dodając równą objętość 4% środka powierzchniowo czynnego w lodowatym TBSE. Uzupełniony supernatant inkubować na lodzie przez jedną godzinę, mieszając przez inwersję co 15 minut. Przenieś probówkę do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez 10 minut, aby wywołać separację faz.
Odwirować próbkę z prędkością 10 000 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby utrzymać dwufazową separację. Delikatnie odpipetować górną fazę wodną i wyrzucić. Dodaj lodowato zimne TBSE do dolnej fazy środka powierzchniowo czynnego, aby napełnić probówkę do jej pierwotnej objętości i odwrócić do mieszania.
Inkubować na lodzie przez 10 minut. Po inkubacji przenieś probówkę do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez 10 minut w celu wywołania separacji faz, a następnie odwiruj przy 10 000 razy g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po powtórzeniu tych kroków jeszcze raz, w sumie trzy separacje, usuń górną fazę wodną i wyrzuć.
Usunąć osad wytrąconych białek, które powstały w trakcie ekstrakcji, dodając jedną objętość lodowatego TBSE do fazy środka powierzchniowo czynnego. Wirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 16 000 razy g przez dwie minuty, aby granulować nierozpuszczalne białko. Natychmiast przenieść supernatant do świeżej 2,0-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 1 250 mikrolitrów 100% acetonu.
Wymieszać próbkę przez odwrócenie i inkubować przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w celu wytrącenia białka. Następnego dnia odwiruj próbkę z prędkością 16 000 razy g przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby granulować lipoproteiny, zwracając uwagę na orientację probówki. Umyj osad dwukrotnie 100% acetonem przed dekantacją acetonu i pozostawieniem próbki do wyschnięcia na powietrzu.
Następnie dodaj od 20 do 40 mikrolitrów 10-milimolowego Tris-HCL, pH 8,0 i dokładnie zawieś osad, pipetując w górę iw dół do ściany z wytrąconymi lipoproteinami.