Selektywne oczyszczanie białka bakteryjnego metodą chromatografii jonowymiennej

Rozpocznij od roztworu żywicy jonowymiennej zawierającego dodatnio naładowane grupy funkcyjne do selektywnego wiązania białek.

Następnie weź ekstrakt białkowy uzyskany z komórek bakteryjnych gospodarza zmodyfikowanych w celu nadekspresji czynnika wirulencji z patogennej bakterii Helicobacter pylori.

Ekstrakt zawiera docelowy czynnik wirulencji wraz z białkami komórek gospodarza w buforze o pH 8.

Wymieszaj ekstrakt białkowy z żywicą i inkubuj z mieszaniem, aby zapewnić równomierną interakcję białko-żywica.

Białka gospodarza, mające punkty izoelektryczne niższe niż pH buforu, stają się naładowane ujemnie i wiążą się z dodatnio naładowaną żywicą.

Białko docelowe, z punktem izoelektrycznym zbliżonym do pH buforu, pozostaje w dużej mierze nienaładowane i nie jest związane.

Przenieść zawiesinę białkowo-żywiczną do kolumny chromatograficznej i pozwolić żywicy osiąść.

Zebrać fazę ciekłą zawierającą niezwiązane białko docelowe.

Przepłucz żywicę buforem, aby zapewnić maksymalny odzysk docelowego białka.

Aby przygotować 15 mililitrów żywicy DEAE, zawiesić 0,6 grama suchego proszku żywicy DEAE w 30 mililitrach buforu Tris-HCl w temperaturze pokojowej przez co najmniej jeden dzień.

Odwirować żywicę w temperaturze 10 000 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant. Następnie dodaj 15 mililitrów buforu Tris-HCl. Po powtórzeniu wirowania, ponownym zawieszeniu jeszcze cztery razy, przechowuj 15 mililitrów osiadłej żywicy w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego użycia.

Pracując w czterech stopniach Celsjusza, dodaj 45 mililitrów przygotowanych rozpuszczalnych białek do 15 mililitrów żywicy i przenieś do 100-mililitrowej zlewki z mieszadłem. Mieszaj zawiesinę żywicy białkowej za pomocą płytki mieszającej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Następnie wlej zawiesinę żywicy białkowej do plastikowej lub szklanej kolumny wyposażonej w zawór odcinający i pozwól żywicy osiąść pod wpływem grawitacji.

Otwórz kurek, aby roztwór białkowy mógł przepływać przez kolumnę przez przepływ grawitacyjny, aż poziom cieczy w kolumnie znajdzie się tuż nad żywicą. Zebrać przepływ jako frakcję niezwiązaną, która zawiera oczyszczone białko aktywujące neutrofile. Dodaj 15 mililitrów lodowatego buforu Tris-HCl do kolumny.

Ponownie otworzyć kurek, aby umożliwić przepływ buforu płuczącego przez kolumnę za pomocą przepływu grawitacyjnego, aż poziom cieczy w kolumnie znajdzie się tuż nad żywicą. Zebrać przepływ jako frakcję płuczącą. Powtórz mycie lodowatym buforem jeszcze cztery razy, aby zebrać dodatkowe frakcje płukania.