JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 4:28 min. • October 30th, 2025
Weźmy hodowlę Streptococcus mutans wykazującą ekspresję białka znakowanego polihistydyną wydzielanego do pożywki.
Odwirować kulturę i zebrać supernatant bogaty w białko.
Dodać siarczan amonu i inkubować mieszając, aby wytrącić białka poprzez zmniejszenie ich rozpuszczalności.
Przenieść roztwór do probówki, odwirować i wyrzucić supernatant.
Zawiesić osad w buforze wiążącym zawierającym sole i niski poziom imidazolu w celu ustabilizowania białka.
Roztworu należy dializować ze świeżym buforem wiążącym w celu usunięcia nadmiaru soli.
Odwirować dializowany roztwór do osadzania nierozpuszczalnych zanieczyszczeń, a następnie przefiltrować supernatant.
Wymieszać filtrat z żywicą powinowactwa naładowaną niklem i inkubować, aby umożliwić selektywne wiązanie białka znakowanego polihistydyną z jonami niklu.
Załadować mieszaninę na kolumnę chromatograficzną i przemyć buforem wiążącym w celu usunięcia niezwiązanych białek.
Następnie dodaj bufor elucyjny z wysokim imidazolem, aby wyprzeć histydynę z jonów niklu i uwolnić białko znakowane polihistydyną.
Zebrać ten eluat zawierający oczyszczone białka.
Odwirować zawiesinę kultur bakteryjnych przez 20 minut w temperaturze 10 000 razy g w temperaturze czterech
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych