Pomiar wiązania leku z kazeum ze zmian gruźliczych za pomocą metody szybkiej dializy równowagowej

Weźmy jednorodną zawiesinę kazeum - nekrotycznego, bogatego w lipidy materiału ze zmian gruźliczych, który zawiera w sobie tolerancyjne na leki prątki.

Dodać badany lek do homogenatu i wiru, aby ułatwić jego interakcję z matrycą kazeum.

Umieścić w płycie podstawy wkładkę do dializy szybkiej równowagi zawierającą komorę dawczą i biorczą oddzieloną półprzepuszczalną membraną.

Załaduj homogenat z dodatkiem leku do komory dawczej i dodaj bufor do komory odbiorczej.

Uszczelnić płytkę i inkubować z rotacją.

Podczas inkubacji wolny lek dyfunduje przez błonę, osiągając równowagę między obiema komorami.

Po osiągnięciu równowagi należy rozcieńczyć próbkę dawcy buforem, a próbkę biorczą homogenatem bezlekowym, aby znormalizować warunki matrycy do oznaczania ilościowego leku.

Na koniec określ ilościowo stężenie leku i oblicz niezwiązaną frakcję leku lub fu.

Fu odzwierciedla wolny lek dostępny do dyfuzji do kazeum i docierania do prątków tolerujących leki.

Dodać 6,5 mikrolitra przygotowanego związku do 643,5 mikrolitra homogenatu. Aby osiągnąć końcowe stężenie pięciu mikromolów i wiru.

Następnie umieść czerwone wkładki w płycie podstawy. Przygotować wkładki do każdego testu, każdy związek w trzech egzemplarzach.

Dodaj 200 mikrolitrów matrycy z dodatkiem leku do czerwonej komory dawcy każdej czerwonej wkładki. Następnie dodaj 350 mikrolitrów PBS do każdej komory odbiorczej.

Umieść uszczelkę samoprzylepną na płytce i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza na mieszalniku termicznym z prędkością 200 obrotów na minutę przez cztery godziny. Po inkubacji delikatnie wymieszać zawartość komory dawczej i biorczej, pipetując w górę i w dół dwa do trzech razy. Przenieś 20 mikrolitrów homogenatu z każdej z komór dawczych do 20 mikrolitrów czystego PBS w probówce o pojemności 1,5 mililitra.

Podobnie, przenieść 20 mikrolitrów podwielokrotności PBS próbek z komór odbiorczych do 20 mikrolitrów czystego homogenatu.

Dopasowanie matrycy eliminuje potrzebę wykonywania dwóch oddzielnych krzywych widzenia kolorów w homogenacie i PBS do analizy ilościowej. Zawartość komory dawczej może z czasem osadzać się. Delikatnie wymieszać zawartość przez pipetowanie przed usunięciem podwielokrotności.